La cromatografía de afinidad logra la separación aprovechando las interacciones biológicas reversibles altamente específicas entre un ligando (inmovilizado en la fase estacionaria) y una molécula diana en la fase móvil. Esta técnica ofrece una selectividad incomparable, logrando a menudo factores de purificación de 1000 veces o más en un solo paso. La fuerza de la interacción se mide mediante la constante de disociación K_d, y las purificaciones por afinidad exitosas típicamente requieren K_d en el rango de 10⁻⁴ a 10⁻¹⁰ M.
El ligando se inmoviliza covalentemente sobre una matriz de soporte a través de un brazo espaciador que reduce el impedimento estérico entre el ligando y la diana. Los ligandos comunes incluyen anticuerpos (para cromatografía de inmunoafinidad), lectinas (para purificación de glicoproteínas), inhibidores enzimáticos (para aislamiento de enzimas) e iones metálicos como Ni²⁺ o Co²⁺ (para cromatografía de afinidad por metales inmovilizados, IMAC). La matriz de soporte debe ser químicamente estable, hidrófila para minimizar la unión no específica y estar disponible en forma de partículas con porosidad controlada. La agarosa (ej., Sepharose 4B) es el soporte más utilizado, a menudo reticulada para mayor resistencia mecánica.
La separación por afinidad procede en tres etapas. Unión: la muestra se carga en condiciones que favorecen la formación del complejo (pH, fuerza iónica y temperatura optimizados). Lavado: los contaminantes no unidos y débilmente unidos se eliminan con un tampón que preserva la interacción ligando-diana. Elución: la diana se libera alterando la interacción, típicamente usando uno de tres enfoques. La elución competitiva desplaza la diana con una alta concentración de ligando libre o un análogo estructural. El cambio de pH altera el estado de ionización de los residuos de unión (ej., glicina-HCl, pH 2,5). El cambio de fuerza iónica altera las interacciones electrostáticas (ej., gradiente de NaCl). Las condiciones de elución deben optimizarse cuidadosamente para mantener la actividad biológica de la diana.
La cromatografía de afinidad es indispensable en la purificación de proteínas. La purificación con His-tag mediante IMAC es el método más empleado: una cola de polihistidina (típicamente 6×His) en la proteína recombinante se une a agarosa Ni²⁺-NTA y se eluye con imidazol. La purificación con GST-tag utiliza agarosa-glutatión para capturar proteínas de fusión con glutatión S-transferasa. La purificación de anticuerpos con Proteína A o Proteína G agarosa es un pilar de la investigación en inmunología, produciendo IgG altamente pura a partir de suero o sobrenadantes de cultivo de hibridomas. Más allá de las proteínas, la cromatografía de afinidad se utiliza para el aislamiento de enzimas (lectina-afinidad para glicoproteínas, NAD⁺-agarosa para deshidrogenasas) y para la purificación de ácidos nucleicos usando celulosa oligo-dT para captura de ARNm.
