亲和色谱法通过利用配体（固定在固定相上）与流动相中的目标分子之间高度特异性、可逆的生物相互作用实现分离。该技术提供无与伦比的选择性，通常在单一步骤中达到1000倍或更高的纯化倍数。相互作用的强度由解离常数K_d衡量，成功的亲和纯化通常需要K_d在10⁻⁴至10⁻¹⁰ M范围内。

配体通过间隔臂共价固定在支持基质上，以减少配体与目标之间的位阻效应。常见配体包括抗体（用于免疫亲和色谱）、凝集素（用于糖蛋白纯化）、酶抑制剂（用于酶分离）和金属离子如Ni²⁺或Co²⁺（用于固定化金属亲和色谱，IMAC）。支持基质必须具有化学稳定性、亲水性以最小化非特异性结合，并具有可控孔率的微球形式。琼脂糖（如Sepharose 4B）是最广泛使用的支持物，常通过交联增加机械强度。

亲和分离分三个阶段进行。结合：在有利于复合物形成的条件下上样（优化的pH、离子强度和温度）。洗涤：使用保持配体-目标相互作用的缓冲液去除未结合和弱结合的污染物。洗脱：通过破坏相互作用释放目标，通常使用三种方法之一。竞争性洗脱用高浓度游离配体或结构类似物置换目标。pH改变改变结合残基的电离状态（如甘氨酸-HCl，pH 2.5）。离子强度改变破坏静电相互作用（如NaCl梯度）。必须仔细优化洗脱条件以保持目标的生物活性。

亲和色谱在蛋白质纯化中不可或缺。使用IMAC的His标签纯化是最广泛使用的方法：重组蛋白上的多聚组氨酸标签（通常为6×His）与Ni²⁺-NTA琼脂糖结合，并用咪唑洗脱。GST标签纯化使用谷胱甘肽-琼脂糖捕获谷胱甘肽S-转移酶融合蛋白。使用蛋白A或蛋白G琼脂糖的抗体纯化是免疫学研究的基石，可从血清或杂交瘤培养上清中获得高纯度IgG。除蛋白质外，亲和色谱还用于酶分离（用于糖蛋白的凝集素亲和色谱，用于脱氢酶的NAD⁺-琼脂糖）和核酸纯化（使用寡聚dT纤维素捕获mRNA）。