亲和色谱通过利用配体（固定在固定相上）和流动相中的目标分子之间的高度特异性、可逆的生物相互作用来实现分离。该技术提供了无与伦比的选择性，通常一步即可实现 1000 倍或更高的纯化系数。相互作用的强度通过解离常数 K_d 来测量，成功的亲和纯化通常需要 K_d 在 10 -4 至 10 -10 M 范围内。

配体通过间隔臂共价固定在支持基质上，从而减少配体和靶标之间的空间位阻。常见的配体包括抗体（用于免疫亲和层析）、凝集素（用于糖蛋白纯化）、酶抑制剂（用于酶分离）和金属离子，例如Ni²⁺或Co²⁺（用于固定化金属亲和层析，IMAC）。支持基质必须具有化学稳定性、亲水性，以最大限度地减少非特异性结合，并以具有受控孔隙率的珠子形式提供。 琼脂糖（例如 Sepharose 4B）是最广泛使用的支持物，通常进行交联以提高机械强度。

亲和分离分三个阶段进行。 结合：在有利于复合物形成的条件（优化的 pH、离子强度和温度）下上样样品。 洗涤：使用保留配体-靶标相互作用的缓冲液去除未结合和弱结合的污染物。 洗脱：通过破坏相互作用来释放靶标，通常使用三种方法之一。 竞争性洗脱 用高浓度的游离配体或结构类似物置换靶标。 pH 变化 改变结合残基的电离状态（例如，甘氨酸-HCl，pH 2.5）。 离子强度变化会破坏静电相互作用（例如，氯化钠梯度）。必须仔细优化洗脱条件以维持目标的生物活性。

亲和层析在蛋白质纯化中是不可或缺的。 [使用 IMAC 进行 His 标签纯化](/guides/his-tag-imac-purification.html)是最广泛使用的方法：重组蛋白上的多组氨酸标签（通常为 6×His）与 Ni²⁺-NTA 琼脂糖结合，并用咪唑洗脱。 GST 标签纯化 使用谷胱甘肽-琼脂糖捕获谷胱甘肽 S-转移酶融合蛋白。 [使用 Protein A 或 Protein G 琼脂糖进行抗体纯化](/guides/protein-ag-purification.html)是免疫学研究的基石，可从血清或杂交瘤培养上清液中产生高纯度的 IgG。除了蛋白质之外，亲和层析还用于酶分离（糖蛋白的凝集素亲和力，脱氢酶的 NAD⁺-琼脂糖）和使用寡聚 dT 纤维素捕获 mRNA 的核酸纯化。