Kromatografi afinitas mencapai pemisahan dengan memanfaatkan interaksi biologis reversibel yang sangat spesifik antara ligan (diimobilisasi pada fase diam) dan molekul target dalam fase gerak. Teknik ini menawarkan selektivitas yang tak tertandingi, sering mencapai faktor pemurnian 1000 kali lipat atau lebih dalam satu langkah. Kekuatan interaksi diukur dengan konstanta disosiasi K_d, dengan pemurnian afinitas yang berhasil biasanya memerlukan K_d dalam rentang 10⁻⁴ hingga 10⁻¹⁰ M.
Ligan diimobilisasi secara kovalen ke matriks pendukung melalui lengan spacer yang mengurangi hambatan sterik antara ligan dan target. Ligan umum meliputi antibodi (untuk kromatografi imunoafinitas), lektin (untuk pemurnian glikoprotein), inhibitor enzim (untuk isolasi enzim), dan ion logam seperti Ni²⁺ atau Co²⁺ (untuk kromatografi afinitas logam terimobilisasi, IMAC). Matriks pendukung harus stabil secara kimia, hidrofilik untuk meminimalkan pengikatan non-spesifik, dan tersedia dalam bentuk manik dengan porositas terkontrol. Agarosa (mis., Sepharose 4B) adalah pendukung yang paling banyak digunakan, sering diikat silang untuk kekuatan mekanik yang lebih besar.
Pemisahan afinitas berlangsung dalam tiga tahap. Pengikatan: sampel dimuat dalam kondisi yang mendukung pembentukan kompleks (pH, kekuatan ionik, dan suhu yang dioptimalkan). Pencucian: kontaminan yang tidak terikat dan terikat lemah dihilangkan dengan buffer yang mempertahankan interaksi ligan-target. Elusi: target dilepaskan dengan mengganggu interaksi, biasanya menggunakan salah satu dari tiga pendekatan. Elusi kompetitif menggantikan target dengan konsentrasi tinggi ligan bebas atau analog struktural. Perubahan pH mengubah keadaan ionisasi residu pengikat (mis., glisin-HCl, pH 2,5). Perubahan kekuatan ionik mengganggu interaksi elektrostatik (mis., gradien NaCl). Kondisi elusi harus dioptimalkan secara hati-hati untuk mempertahankan aktivitas biologis target.
Kromatografi afinitas sangat diperlukan dalam pemurnian protein. Pemurnian His-tag menggunakan IMAC adalah metode yang paling banyak digunakan: tag polihistidina (biasanya 6×His) pada protein rekombinan berikatan dengan agarosa Ni²⁺-NTA dan dielusi dengan imidazol. Pemurnian GST-tag menggunakan glutathion-agarosa untuk menangkap protein fusi glutathion S-transferase. Pemurnian antibodi dengan Protein A atau Protein G agarosa adalah landasan penelitian imunologi, menghasilkan IgG berkemurnian tinggi dari serum atau supernatan kultur hibridoma. Di luar protein, kromatografi afinitas digunakan untuk isolasi enzim (afinitas lektin untuk glikoprotein, NAD⁺-agarosa untuk dehidrogenase) dan untuk pemurnian asam nukleat menggunakan selulosa oligo-dT untuk penangkapan mRNA.
