A cromatografia de afinidade realiza a separação explorando as interações biológicas altamente específicas e reversíveis entre um ligante (imobilizado na fase estacionária) e uma molécula alvo na fase móvel. Esta técnica oferece seletividade incomparável, frequentemente alcançando fatores de purificação de 1000 vezes ou mais em uma única etapa. A força da interação é medida pela constante de dissociação K_d, com purificações por afinidade bem-sucedidas tipicamente requerendo K_d na faixa de 10⁻⁴ a 10⁻¹⁰ M.
O ligante é imobilizado covalentemente em uma matriz de suporte através de um braço espaçador que reduz o impedimento estérico entre o ligante e o alvo. Ligantes comuns incluem anticorpos (para cromatografia de imunoafinidade), lectinas (para purificação de glicoproteínas), inibidores enzimáticos (para isolamento de enzimas) e íons metálicos como Ni²⁺ ou Co²⁺ (para cromatografia de afinidade por metal imobilizado, IMAC). A matriz de suporte deve ser quimicamente estável, hidrofílica para minimizar ligações inespecíficas e estar disponível em forma de partículas com porosidade controlada. A agarose (ex.: Sepharose 4B) é o suporte mais amplamente utilizado, frequentemente reticulada para maior resistência mecânica.
A separação por afinidade ocorre em três etapas. Ligação: a amostra é carregada sob condições que favorecem a formação do complexo (pH, força iônica e temperatura otimizados). Lavagem: contaminantes não ligados e fracamente ligados são removidos com um tampão que preserva a interação ligante-alvo. Eluição: o alvo é liberado rompendo a interação, tipicamente usando uma de três abordagens. A eluição competitiva desloca o alvo com uma alta concentração de ligante livre ou de um análogo estrutural. A mudança de pH altera o estado de ionização dos resíduos de ligação (ex.: glicina-HCl, pH 2,5). A mudança de força iônica rompe interações eletrostáticas (ex.: gradiente de NaCl). As condições de eluição devem ser cuidadosamente otimizadas para manter a atividade biológica do alvo.
A cromatografia de afinidade é indispensável na purificação de proteínas. A purificação por cauda de histidina (His-tag) usando IMAC é o método mais amplamente empregado: uma cauda de polihistidina (tipicamente 6×His) na proteína recombinante se liga à agarose Ni²⁺-NTA e é eluída com imidazol. A purificação por GST-tag usa agarose-glutationa para capturar proteínas de fusão com glutationa S-transferase. A purificação de anticorpos com Proteína A ou Proteína G agarose é uma pedra angular da pesquisa em imunologia, produzindo IgG de alta pureza a partir de soro ou sobrenadantes de cultivo de hibridomas. Além de proteínas, a cromatografia de afinidade é usada para isolamento de enzimas (lectina-afinidade para glicoproteínas, NAD⁺-agarose para desidrogenases) e para purificação de ácidos nucleicos usando celulose oligo-dT para captura de mRNA.
