A proteômica é o estudo em larga escala de proteínas, suas estruturas, funções, interações e modificações. Diferentemente do genoma, que é relativamente estático, o proteoma é dinâmico e reflete o estado da célula, com expressão proteica, localização, modificação e renovação todas sujeitas a regulação.

Princípios da Espectrometria de Massas

A espectrometria de massas mede a razão massa-carga de moléculas ionizadas. Um espectrômetro de massas tem três componentes essenciais. A fonte de íons converte moléculas em íons em fase gasosa. O analisador de massas separa os íons por sua razão massa-carga. O detector mede a abundância de cada íon. Proteínas e peptídeos são tipicamente analisados usando ionização por electrospray ou ionização por dessorção a laser assistida por matriz.

A ionização por electrospray produz íons multiplamente carregados a partir de peptídeos em solução, gerando uma série de picos a partir dos quais a massa molecular pode ser calculada. MALDI tipicamente produz íons com carga única a partir de peptídeos incorporados em uma matriz cristalina e dessorvidos por um pulso de laser. Ambos os métodos são técnicas de ionização suave que preservam a integridade do analito.

Analisadores de Massa

Vários tipos de analisadores de massa são usados em proteômica. Filtros de massa quadrupolares transmitem íons de uma razão massa-carga selecionada através de quatro barras paralelas com campos elétricos oscilantes. Analisadores por tempo de voo medem o tempo que os íons levam para percorrer uma distância fixa, com íons mais leves chegando mais rápido. Analisadores Orbitrap capturam íons em um campo eletrostático e medem suas frequências de oscilação, fornecendo alta resolução e precisão de massa. Analisadores de armadilha de íons confinam íons em um campo elétrico tridimensional e os ejetam sequencialmente. Instrumentos híbridos combinando múltiplos tipos de analisadores, como quadrupolo-Orbitrap ou instrumentos triplo quadrupolo, fornecem flexibilidade para diferentes estratégias experimentais.

Proteômica Bottom-Up

A proteômica bottom-up analisa proteínas (frequentemente separadas por SDS-PAGE) após digestão em peptídeos, tipicamente usando tripsina, que cliva após resíduos de arginina e lisina. A mistura de peptídeos resultante é separada por cromatografia líquida e analisada por espectrometria de massas em tandem. Na aquisição dependente de dados, o espectrômetro de massas seleciona os íons peptídicos mais abundantes para fragmentação por dissociação induzida por colisão. Os espectros de íons fragmento resultantes são pesquisados contra bancos de dados de sequências proteicas para identificar os peptídeos e suas proteínas parentais.

Espectrometria de Massas em Tandem

Na espectrometria de massas em tandem, um íon precursor de uma razão massa-carga específica é selecionado e fragmentado, e as massas dos íons fragmento são medidas. A dissociação induzida por colisão fragmenta peptídeos principalmente nas ligações amida, produzindo íons b e y. A diferença de massa entre íons y adjacentes ou íons b revela a sequência de aminoácidos. Métodos de fragmentação de alta energia como dissociação por transferência de elétrons fornecem informação complementar, preservando modificações pós-traducionais lábeis.

Identificação de Proteínas

A identificação de proteínas a partir de espectros de massas em tandem usa mecanismos de busca de bancos de dados como Mascot, Sequest ou MaxQuant. As massas de íons fragmento observadas são comparadas com espectros teóricos gerados a partir da digestão in silico de sequências de proteínas em um banco de dados. A análise estatística determina a confiança de cada identificação. O sequenciamento de novo, que deriva a sequência do peptídeo diretamente do espectro de massas sem um banco de dados, é usado para organismos com genomas não sequenciados ou para identificar peptídeos novos.

Proteômica Quantitativa

A proteômica quantitativa mede mudanças na abundância de proteínas entre condições. Métodos baseados em marcadores introduzem isótopos estáveis que são distinguidos por deslocamentos de massa. SILAC incorpora aminoácidos isotopicamente marcados através de marcação metabólica em cultura de células. TMT e iTRAQ usam marcadores químicos que liberam íons repórteres durante a fragmentação, permitindo quantificação multiplexada de até 16 amostras. A quantificação sem marcadores compara intensidades de íons peptídicos ou contagens espectrais entre corridas, exigindo normalização cuidadosa.

Análise de Modificações Pós-Traducionais

A espectrometria de massas é excepcionalmente adequada para identificar e localizar modificações pós-traducionais. A fosforilação é detectada por um aumento de massa característico de 80 Da e uma perda neutra de ácido fosfórico durante a fragmentação. Métodos de enriquecimento como cromatografia de afinidade por metal imobilizado ou cromatografia de dióxido de titânio são usados para purificar fosfopeptídeos antes da análise. A glicosilação é mais desafiadora porque glicopeptídeos fragmentam mal e as estruturas de glicano são heterogêneas. Métodos especializados de fragmentação como dissociação por transferência de elétrons preservam ligações glicano-peptídeo, permitindo análise sítio-específica.

Proteômica Clínica

A proteômica clínica aplica tecnologias proteômicas a problemas médicos. A descoberta de biomarcadores identifica proteínas cuja abundância muda na doença, potencialmente permitindo diagnóstico precoce ou monitoramento de tratamento usando técnicas como ELISA. A proteômica de tecidos analisa espécimes clínicos fixados em formalina e embebidos em parafina. A proteômica de plasma enfrenta desafios devido à enorme faixa dinâmica de concentrações proteicas, com a albumina sozinha constituindo mais da metade da proteína total. A depleção por afinidade de proteínas abundantes e fracionamento extenso são tipicamente necessários para análise profunda do proteoma do plasma.