Die Affinitätschromatographie erreicht die Trennung durch die Nutzung der hochspezifischen, reversiblen biologischen Wechselwirkungen zwischen einem Liganden (immobilisiert auf der stationären Phase) und einem Zielmolekül in der mobilen Phase. Diese Technik bietet eine beispiellose Selektivität und erreicht oft Aufreinigungsfaktoren von 1000-fach oder mehr in einem einzigen Schritt. Die Stärke der Wechselwirkung wird durch die Dissoziationskonstante K_d gemessen, wobei erfolgreiche Affinitätsaufreinigungen typischerweise K_d im Bereich von 10⁻⁴ bis 10⁻¹⁰ M erfordern.

Der Ligand wird kovalent über einen Spacerarm auf einer Trägermatrix immobilisiert, der die sterische Hinderung zwischen Ligand und Zielmolekül verringert. Übliche Liganden sind Antikörper (für die Immunaffinitätschromatographie), Lektine (für die Glykoproteinreinigung), Enzyminhibitoren (für die Enzymisolierung) und Metallionen wie Ni²⁺ oder Co²⁺ (für die immobilisierte Metallionen-Affinitätschromatographie, IMAC). Die Trägermatrix muss chemisch stabil, hydrophil (zur Minimierung unspezifischer Bindungen) und in Perlenform mit kontrollierter Porosität verfügbar sein. Agarose (z. B. Sepharose 4B) ist der am häufigsten verwendete Träger, der oft quervernetzt wird, um die mechanische Stabilität zu erhöhen.

Die Affinitätstrennung erfolgt in drei Schritten. Bindung: Die Probe wird unter Bedingungen aufgetragen, die die Komplexbildung begünstigen (optimierter pH-Wert, Ionenstärke und Temperatur). Waschen: Nicht gebundene und schwach gebundene Verunreinigungen werden mit einem Puffer entfernt, der die Ligand-Zielmolekül-Wechselwirkung erhält. Elution: Das Zielmolekül wird durch Störung der Wechselwirkung freigesetzt, typischerweise mit einem von drei Ansätzen. Die kompetitive Elution verdrängt das Zielmolekül mit einer hohen Konzentration an freiem Liganden oder einem Strukturanalogon. Die pH-Änderung verändert den Ionisierungszustand der bindenden Reste (z. B. Glycin-HCl, pH 2,5). Die Änderung der Ionenstärke stört elektrostatische Wechselwirkungen (z. B. NaCl-Gradient). Die Elutionsbedingungen müssen sorgfältig optimiert werden, um die biologische Aktivität des Zielmoleküls zu erhalten.

Die Affinitätschromatographie ist in der Proteinreinigung unverzichtbar. Die His-Tag-Reinigung mittels IMAC ist die am weitesten verbreitete Methode: Ein Polyhistidin-Tag (typischerweise 6×His) am rekombinanten Protein bindet an Ni²⁺-NTA-Agarose und wird mit Imidazol eluiert. Die GST-Tag-Reinigung verwendet Glutathion-Agarose zur Gewinnung von Glutathion-S-Transferase-Fusionsproteinen. Die Antikörperreinigung mit Protein A oder Protein G Agarose ist ein Eckpfeiler der Immunologie-Forschung und liefert hochreines IgG aus Serum oder Hybridoma-Zellkulturüberständen. Über Proteine hinaus wird die Affinitätschromatographie zur Enzymisolierung (Lektin-Affinität für Glykoproteine, NAD⁺-Agarose für Dehydrogenasen) und zur Nukleinsäurereinigung mittels Oligo-dT-Cellulose zur mRNA-Gewinnung eingesetzt.