Visión General

La proteómica top-down analiza proteínas intactas mediante espectrometría de masas sin digestión enzimática previa. A diferencia del enfoque convencional bottom-up que infiere identidades de proteínas a partir de péptidos, la proteómica top-down mide la masa intacta de una proteína y posteriormente la fragmenta dentro del espectrómetro de masas para obtener información de secuencia. Este enfoque preserva el contexto completo de la proteína, lo que significa que las combinaciones de modificaciones postraduccionales, variantes de secuencia y formas de empalme alternativas — denominadas colectivamente proteoformas — se observan como especies moleculares distintas. La proteómica top-down proporciona por tanto una visión directa e inequívoca del panorama de proteoformas que es en gran medida invisible para los métodos bottom-up.

Métodos

Los iones de proteínas intactas se introducen en el espectrómetro de masas mediante ionización por electrospray, que genera una envolvente de estados de carga a partir de la cual se calcula la masa molecular. La fragmentación se logra mediante técnicas como la disociación por captura de electrones (ECD) o la disociación por transferencia de electrones (ETD), que rompen preferentemente el esqueleto de la proteína mientras preservan modificaciones lábiles como fosforilación y glicosilación. La identificación de proteoformas se basa en algoritmos que comparan la masa intacta medida y los iones de fragmentos contra una base de datos de proteoformas predichas. Los espectrómetros de masas de ultra alta resolución como los de resonancia de ciclotrón iónico por transformada de Fourier (FT-ICR) y los instrumentos Orbitrap son esenciales para resolver las pequeñas diferencias de masa entre proteoformas relacionadas.

Aplicaciones

La proteómica top-down sobresale en la caracterización de modificaciones postraduccionales y sus patrones combinatorios en proteínas individuales. Se utiliza para estudiar los códigos de modificación de histonas, la heterogeneidad de anticuerpos y los productos de degradación de proteínas. El enfoque complementa la proteómica y espectrometría de masas bottom-up y se beneficia de la misma instrumentación de espectrometría de masas, proporcionando información única sobre la biología de las proteoformas que es crítica para comprender los mecanismos de enfermedad y desarrollar terapias de precisión.