O sistema de duplo-híbrido em levedura detecta interações proteína-proteína em células de levedura vivas reconstituindo um fator de transcrição funcional. É um método poderoso e amplamente utilizado para descobrir e caracterizar interações binárias entre proteínas.

Princípio

O sistema é baseado na natureza modular dos fatores de transcrição, que possuem domínios de ligação ao DNA e de ativação separáveis. A proteína de interesse, ou isca, é fusionada ao domínio de ligação ao DNA de um fator de transcrição como Gal4. Proteínas potencialmente interativas, ou presas, são fusionadas ao domínio de ativação. A interação entre isca e presa aproxima o domínio de ativação do domínio de ligação ao DNA, reconstituindo um fator de transcrição funcional que ativa a expressão de genes repórteres.

Componentes

A isca é tipicamente clonada em um vetor que expressa a proteína isca fusionada ao domínio de ligação ao DNA de Gal4. A presa é expressa a partir de um vetor de biblioteca fusionado ao domínio de ativação de Gal4. Ambos os plasmídeos são transformados em uma linhagem repórter de levedura contendo um ou mais genes repórteres sob o controle de sequências de ativação a montante responsivas a Gal4.

Genes repórteres comumente incluem HIS3, que permite crescimento em meio deficiente em histidina, ADE2 para biossíntese de adenina e lacZ ou GFP para detecção colorimétrica ou fluorescente. Repórteres múltiplos com diferentes promotores reduzem falsos positivos. Marcadores contra-selecionáveis como URA3 e CYH2 podem eliminar falsos positivos por seleção negativa sob certas condições.

Triagem de Biblioteca

Uma triagem Y2H típica começa com a construção de uma biblioteca de cDNA no vetor de presa. A isca é transformada na linhagem repórter de levedura, e a biblioteca de presas é introduzida por transformação em larga escala. Os transformantes são plaqueados em meio seletivo que requer interação para crescimento. Colônias que aparecem após 3 a 7 dias são coletadas, e os plasmídeos de presa são recuperados e sequenciados para identificar a proteína interativa.

A triagem requer otimização cuidadosa. A isca deve ser testada para autoativação, onde a isca sozinha ativa a transcrição do repórter. Se ocorrer autoativação, a isca pode ser truncada ou vetores alternativos podem ser usados. O nível de expressão tanto da isca quanto da presa afeta a sensibilidade. Triagens de alto rendimento usando automação e estratégias de pooling permitem o mapeamento de interações de proteomas inteiros.

Vantagens e Limitações

O Y2H detecta interações diretas e binárias e pode identificar interações fracas ou transitórias que podem não ser detectadas por co-imunoprecipitação e outros métodos bioquímicos de extração e purificação de proteínas. O sistema é escalável para alto rendimento, econômico e não requer anticorpos específicos para proteínas. As interações são detectadas em um ambiente celular eucariótico.

As limitações incluem falsos positivos de autoativadores, proteínas adesivas e interações fortuitas. Falsos negativos ocorrem quando as proteínas não se enovelam adequadamente em levedura, requerem modificações pós-traducionais ausentes em levedura ou são tóxicas quando superexpressas. Proteínas de membrana são problemáticas porque a localização nuclear do sistema é incompatível com ambientes de membrana. Variantes como o sistema de ubiquitina dividida abordam algumas dessas limitações.

Variantes

Várias variantes do Y2H estendem a técnica básica. O sistema de duplo-híbrido reverso detecta a interrupção de interações pela triagem de perda de expressão do repórter, útil para identificar mutações ou fármacos que interrompem interações específicas. O sistema de um híbrido detecta interações proteína-DNA fusionando o domínio de ligação ao DNA a um fator de transcrição conhecido e triando por ativação. O sistema de três híbridos detecta interações RNA-proteína usando uma molécula de RNA híbrida que conecta a isca e a presa.

O duplo-híbrido de membrana usa a abordagem de ubiquitina dividida, onde isca e presa são fusionadas a metades da ubiquitina. A interação reconstitui a ubiquitina completa, que é clivada por proteases específicas de ubiquitina, liberando um fator de transcrição que ativa genes repórteres. Isso permite a detecção de interações envolvendo proteínas de membrana em seu ambiente nativo.

Aplicações

O Y2H tem sido usado para gerar mapas de interação em escala de proteoma para organismos incluindo levedura, mosca, verme e humano. Esses mapas revelam módulos funcionais, identificam novos componentes de vias e predizem funções de proteínas não caracterizadas. Triagens Y2H identificaram interações relevantes para doenças, como interações entre proteínas codificadas por genes ligados a distúrbios genéticos. A tecnologia também foi aplicada para mapear interações hospedeiro-patógeno, revelando como proteínas virais e bacterianas subvertem a maquinaria celular do hospedeiro.