酵母双杂交系统通过在活酵母细胞中重建功能性转录因子来检测蛋白质-蛋白质相互作用。它是一种强大且广泛使用的发现和表征二元蛋白质相互作用的方法。
原理
该系统基于转录因子的模块化性质，其具有可分离的DNA结合结构域和激活结构域。目标蛋白（诱饵）与转录因子（如Gal4）的DNA结合结构域融合。潜在相互作用蛋白（猎物）与激活结构域融合。诱饵和猎物之间的相互作用将激活结构域带到DNA结合结构域附近，重建功能性转录因子，激活报告基因表达。
组分
诱饵通常克隆到表达与Gal4 DNA结合结构域融合的诱饵蛋白的载体中。猎物从与Gal4激活结构域融合的文库载体表达。两种质粒转化到含有在Gal4响应上游激活序列控制下的一个或多个报告基因的酵母报告菌株中。
报告基因通常包括HIS3（允许在缺乏组氨酸的培养基上生长）、ADE2（用于腺嘌呤生物合成）以及lacZ或GFP（用于比色或荧光检测）。具有不同启动子的多个报告基因减少假阳性。反选择标记如URA3和CYH2可在某些条件下通过负选择消除假阳性。
文库筛选
典型的Y2H筛选始于在猎物载体中构建cDNA文库。诱饵转化到酵母报告菌株中，猎物文库通过大规模转化引入。转化体铺板在需要相互作用才能生长的选择性培养基上。3至7天后出现的菌落被挑取，猎物质粒被回收和测序以鉴定相互作用的蛋白。
筛选需要仔细优化。诱饵必须测试自激活（诱饵单独激活报告转录）。如果发生自激活，可以截短诱饵或使用替代载体。诱饵和猎物的表达水平影响灵敏度。使用自动化和池化策略的高通量筛选可实现全蛋白质组相互作用图谱。
优势和局限性
Y2H检测直接的二元相互作用，可以识别可能被免疫共沉淀和其他生化蛋白质提取和纯化方法遗漏的弱或瞬时相互作用。该系统可扩展用于高通量，具有成本效益，且不需要蛋白质特异性抗体。相互作用在其核细胞环境中检测。
局限性包括来自自激活剂、粘性蛋白和偶然相互作用的假阳性。当蛋白质在酵母中无法正确折叠、需要酵母中缺乏的翻译后修饰或过表达时有毒时，会发生假阴性。膜蛋白存在问题，因为系统的核定位与膜环境不兼容。变体如分裂泛素系统解决了其中一些局限性。
变体
几种Y2H变体扩展了基本技术。反向双杂交系统通过筛选报告表达缺失来检测相互作用的破坏，用于识别破坏特定相互作用的突变或药物。单杂交系统通过将DNA结合结构域与已知转录因子融合并筛选激活来检测蛋白质-DNA相互作用。三杂交系统通过使用连接诱饵和猎物的杂交RNA分子检测RNA-蛋白质相互作用。
膜酵母双杂交使用分裂泛素方法，其中诱饵和猎物与泛素的两半融合。相互作用重建完整的泛素，被泛素特异性蛋白酶切割，释放激活报告基因的转录因子。这允许在其天然环境中检测涉及膜蛋白的相互作用。
应用
Y2H已被用于生成包括酵母、果蝇、线虫和人类在内的生物体的蛋白质组规模相互作用图谱。这些图谱揭示功能模块，识别新的途径组分，并预测未表征蛋白质的功能。Y2H筛选已鉴定出与疾病相关的相互作用，例如由与遗传性疾病相关的基因编码的蛋白质之间的相互作用。该技术也被应用于绘制宿主-病原体相互作用图谱，揭示病毒和细菌蛋白如何颠覆宿主细胞机制。
