Bei der DNA-Ligation und -Klonierung handelt es sich um eine Reihe von Techniken, mit denen DNA-Fragmente zusammengefügt und in einen Vektor – ein Träger-DNA-Molekül – eingefügt werden, um sie in einem Wirtsorganismus, typischerweise Bakterien, zu replizieren. Dadurch können Wissenschaftler große Mengen einer bestimmten DNA-Sequenz produzieren.
Wie DNA-Ligation und Klonen funktionieren
- Vorbereiten des Einsatzes und Vektors
Sowohl das interessierende DNA-Fragment (das Insert) als auch der Vektor (normalerweise ein Plasmid) werden mit denselben Restriktionsenzymen geschnitten. Dadurch entstehen komplementäre klebrige Enden – kurze, einzelsträngige Überhänge, die Basenpaare miteinander bilden können.
- Ligation
Das geschnittene Insert und der Vektor werden mit DNA-Ligase vermischt, einem Enzym, das das Zucker-Phosphat-Rückgrat der DNA versiegelt. Die komplementären klebrigen Enden richten sich aus und die Ligase bildet kovalente Bindungen, die das Insert dauerhaft mit dem Vektor verbinden.
- Transformation
Das ligierte Plasmid wird durch einen als Transformation bezeichneten Prozess in kompetente Bakterienzellen eingeführt. Dies wird häufig durch Hitzeschock oder Elektroporation erreicht, wodurch die Bakterienmembran vorübergehend für DNA durchlässig wird.
- Auswahl
Die transformierten Bakterien werden auf Agar mit einem Antibiotikum ausplattiert. Das Plasmid trägt ein Antibiotikaresistenzgen, sodass nur Bakterien überleben, die das Plasmid aufgenommen haben. Dadurch entstehen Kolonien, die jeweils von einer einzelnen Zelle abstammen, die die geklonte DNA enthält.
- Screening
Kolonien werden durch Kolonie-PCR oder Restriktionsverdau gescreent, um zu bestätigen, dass sie das richtige Insert enthalten. Positive Kolonien werden in Flüssigkultur gezüchtet, um große Mengen des gewünschten Plasmids zu produzieren.
