Kolonie-PCR ist eine schnelle Screening-Technik, mit der festgestellt wird, ob Bakterienkolonien ein Plasmid mit dem richtigen DNA-Insert enthalten. Anstatt zunächst die Plasmid-DNA jeder Kolonie zu reinigen, wird die PCR direkt an einer kleinen Menge Bakterienzellen durchgeführt.
So funktioniert die Kolonie-PCR
- Kolonieauswahl
Einzelne auf einer Agarplatte wachsende Bakterienkolonien werden mit einer sterilen Pipettenspitze oder einem Zahnstocher gepflückt. Jede Kolonie wird kurz berührt, wodurch eine winzige Menge Zellen übertragen wird. Mit der gleichen Spitze werden sowohl das PCR-Röhrchen als auch eine Masterplatte für die spätere Kultur beimpft.
- Zelllyse
Im ersten Denaturierungsschritt der PCR werden die Bakterienzellen mehrere Minuten lang auf 95 °C erhitzt. Durch diese Wärmebehandlung werden die Zellen lysiert und die Plasmid-DNA in die Reaktionsmischung freigesetzt. Die freigesetzte DNA dient dann als Matrize für die Amplifikation.
- PCR-Amplifikation
Es werden Primer verwendet, die die Insert-Region im Plasmid flankieren. Wenn die Kolonie ein Plasmid mit dem richtigen Insert enthält, erzeugt die PCR eine Bande in der erwarteten Größe. Wenn das Plasmid leer ist (kein Insert), ist die Bande kleiner. Wenn die Kolonie das Plasmid überhaupt nicht enthält, wird keine Bande erzeugt.
- Gelanalyse
Die PCR-Produkte werden mittels Agarose-Gelelektrophorese analysiert. Kolonien, die eine Bande mit der erwarteten Insertgröße bilden, werden als positiv identifiziert. Diese Kolonien können dann zur Plasmidreinigung und weiteren Analyse gezüchtet werden.
- Vorteile
Die Kolonie-PCR ist schnell und kostengünstig und ermöglicht das Screening Dutzender Kolonien in wenigen Stunden. Es macht eine Plasmidreinigung vor dem Screening überflüssig und ist ein standardmäßiger erster Schritt in Arbeitsabläufen zum molekularen Klonen.
