Kolonie-PCR ist eine schnelle Screening-Technik, mit der festgestellt wird, ob Bakterienkolonien ein Plasmid mit dem richtigen DNA-Insert enthalten. Anstatt zunächst die Plasmid-DNA jeder Kolonie zu reinigen, wird die PCR direkt an einer kleinen Menge Bakterienzellen durchgeführt.
So funktioniert die Kolonie-PCR
- Kolonieauswahl
Einzelne auf einer Agarplatte wachsende Bakterienkolonien werden mit einer sterilen Pipettenspitze oder einem Zahnstocher gepflückt. Jede Kolonie wird kurz berührt, wodurch eine winzige Menge Zellen übertragen wird. Mit der gleichen Spitze werden sowohl das PCR-Röhrchen als auch eine Masterplatte für die spätere Kultur beimpft.
- Zelllyse
Im ersten Denaturierungsschritt der PCR werden die Bakterienzellen mehrere Minuten lang auf 95 °C erhitzt. Durch diese Wärmebehandlung werden die Zellen lysiert und die Plasmid-DNA in die Reaktionsmischung freigesetzt. Die freigesetzte DNA dient dann als Matrize für die Amplifikation.
- PCR-Amplifikation
Es werden Primer verwendet, die die Insert-Region im Plasmid flankieren. Wenn die Kolonie ein Plasmid mit dem richtigen Insert enthält, erzeugt die PCR eine Bande in der erwarteten Größe. Wenn das Plasmid leer ist (kein Insert), ist die Bande kleiner. Wenn die Kolonie das Plasmid überhaupt nicht enthält, wird keine Bande erzeugt.
- Gelanalyse
Die PCR-Produkte werden mittels Agarose-Gelelektrophorese analysiert. Kolonien, die eine Bande mit der erwarteten Insertgröße bilden, werden als positiv identifiziert. Diese Kolonien können dann zur Plasmidreinigung und weiteren Analyse gezüchtet werden.
- Vorteile
Die Kolonie-PCR ist schnell und kostengünstig und ermöglicht das Screening Dutzender Kolonien in wenigen Stunden. Es macht eine Plasmidreinigung vor dem Screening überflüssig und ist ein standardmäßiger erster Schritt in Arbeitsabläufen zum molekularen Klonen.
Praktisches Kolonie-PCR-Protokoll
Wählen Sie mit einer sterilen 10-µL-Pipettenspitze einzelne Bakterienkolonien von einer selektiven Agarplatte aus. Berühren Sie eine einzelne Kolonie leicht – vermeiden Sie die Übertragung eines großen Zellklumpens. Streichen Sie die Spitze auf eine frische Masterplatte (gerastertes LB-Agar mit Antibiotikum), um den Klon zu konservieren, und tauchen Sie dann dieselbe Spitze in ein PCR-Röhrchen mit 20–25 µL Mastermix und schwenken Sie es. Bereiten Sie für jede Kolonie die Mischung vor: 12,5 µL 2× PCR-Master-Mix, je 0,5 µL Vorwärts- und Rückwärtsprimer (10 µM), 1 µL Vorlage (die Kolonie) und Wasser auf 25 µL. Verwenden Sie vektorspezifische Primer, die das Insert flankieren (z. B. M13 vorwärts/rückwärts oder T7/SP6) oder insertspezifische interne Primer. Führen Sie die PCR mit einer verlängerten anfänglichen Denaturierung bei 95 °C für 5–10 Minuten durch, um eine vollständige Bakterienlyse und DNA-Freisetzung sicherzustellen. Es folgen 30–35 Zyklen mit 95 °C für 30 Sekunden, 55 °C für 30 Sekunden und 72 °C für 1 Minute pro kb des erwarteten Einsatzes, mit einer abschließenden Verlängerung bei 72 °C für 5 Minuten. Analysieren Sie 5–10 µL jeder Reaktion durch Agarosegelelektrophorese. Eine Bande in der erwarteten Insertgröße weist auf einen positiven Klon hin. Wenn keine Bande erscheint, fehlt der Kolonie möglicherweise das Plasmid, sie enthält einen leeren Vektor (was zu einer kleineren Bande führt) oder die Lyse war unzureichend – reduzieren Sie die Menge der übertragenen Bakterienzellen. Fügen Sie bei hartnäckigen grampositiven Bakterien 0,5 µL Lysozym (50 mg/ml) zum PCR-Mix hinzu oder führen Sie vor der PCR eine Gefrier-Auftau-Lyse durch.
Reale Anwendung
Beim Klonieren einer 1,2 kb großen GFP-Expressionskassette in pET-28a werden die Transformanten auf Kanamycin-Agar ausplattiert. Von 24 Kolonien, die durch Kolonie-PCR mit T7-Promotor und Terminatorprimern gescreent wurden, zeigen 18 eine 1,2-kb-Bande, 4 zeigen die leere Vektorbande (300 bp) und 2 produzieren keine Bande. Die 18 positiven Klone werden zur Plasmidreinigung und -sequenzierung verwendet und bestätigen die erfolgreiche Klonierung in weniger als 4 Stunden.
