Die Plasmidreinigung, auch Miniprep genannt, ist eine Technik zur Isolierung kleiner zirkulärer DNA-Moleküle (Plasmide) aus Bakterienzellen. Plasmide werden häufig als Vektoren beim molekularen Klonen verwendet, und ihre Reinigung ist für die Sequenzierung, Transfektion und weitere Manipulation unerlässlich.
Wie die Plasmidreinigung funktioniert
- Bakterienkultur
Eine einzelne Bakterienkolonie, die das gewünschte Plasmid enthält, wird über Nacht in flüssigem Medium mit dem geeigneten Antibiotikum gezüchtet. Dadurch wird sichergestellt, dass die Bakterien das Plasmid behalten und ausreichend für die Extraktion produzieren.
- Zellernte und Lyse
Die Bakterienkultur wird zentrifugiert, um die Zellen zu pelletieren. Das Pellet wird in einem RNase-haltigen Puffer resuspendiert (um RNA zu verdauen) und dann mit einer alkalischen Lyselösung behandelt, die SDS und Natriumhydroxid enthält. Dadurch werden die Zellen aufgebrochen und die DNA denaturiert.
- Neutralisierung
Ein Neutralisationspuffer, der Kaliumacetat enthält, wird hinzugefügt. Die hohe Salzkonzentration führt dazu, dass die denaturierte chromosomale DNA und Proteine ausfallen, während die kleinere, superspiralisierte Plasmid-DNA in Lösung bleibt. Die Mischung wird zentrifugiert und der plasmidhaltige Überstand wird gesammelt.
- Binden und Waschen
Der Überstand wird unter Bedingungen, die eine Bindung der Plasmid-DNA bewirken, durch eine Silica-Membransäule geleitet. Ein Waschpuffer entfernt verbleibende Verunreinigungen wie Salze, Proteine und RNA.
- Elution
Die gereinigte Plasmid-DNA wird mit einem salzarmen Puffer oder Wasser von der Membran freigesetzt. Die resultierende DNA ist rein genug für die Sequenzierung, den Restriktionsverdau oder die Transfektion eukaryontischer Zellen.
