La purification de plasmides, également connue sous le nom de miniprep, est une technique utilisée pour isoler de petites molécules d’ADN circulaire (plasmides) à partir de cellules bactériennes. Les plasmides sont couramment utilisés comme vecteurs dans le clonage moléculaire, et leur purification est essentielle pour le séquençage, la transfection et d’autres manipulations.
Comment Fonctionne la Purification de Plasmides
- Culture Bactérienne
Une seule colonie bactérienne contenant le plasmide désiré est cultivée toute une nuit dans un milieu liquide avec l’antibiotique approprié. Cela garantit que les bactéries maintiennent le plasmide et en produisent suffisamment pour l’extraction.
- Récolte et Lyse Cellulaires
La culture bactérienne est centrifugée pour culotter les cellules. Le culot est remis en suspension dans un tampon contenant de la RNase (pour digérer l’ARN) puis traité avec une solution de lyse alcaline contenant du SDS et de l’hydroxyde de sodium. Cela brise les cellules et dénature l’ADN.
- Neutralisation
Un tampon de neutralisation contenant de l’acétate de potassium est ajouté. La concentration élevée en sel provoque la précipitation de l’ADN chromosomique dénaturé et des protéines, tandis que l’ADN plasmidique plus petit et superenroulé reste en solution. Le mélange est centrifugé, et le surnageant contenant le plasmide est récupéré.
- Liaison et Lavage
Le surnageant est passé à travers une colonne à membrane de silice dans des conditions qui permettent à l’ADN plasmidique de s’y lier. Un tampon de lavage élimine les contaminants restants tels que les sels, les protéines et l’ARN.
- Élution
L’ADN plasmidique purifié est libéré de la membrane en utilisant un tampon à faible teneur en sel ou de l’eau. L’ADN obtenu est suffisamment pur pour le séquençage, la digestion par restriction ou la transfection de cellules eucaryotes.
