A purificação de plasmídeos, também conhecida como miniprep, é uma técnica usada para isolar pequenas moléculas circulares de DNA (plasmídeos) de células bacterianas. Plasmídeos são comumente usados como vetores em clonagem molecular, e purificá-los é essencial para sequenciamento, transfecção e manipulações posteriores.
Como Funciona a Purificação de Plasmídeos
- Cultura Bacteriana
Uma única colônia bacteriana contendo o plasmídeo desejado é cultivada durante a noite em meio líquido com o antibiótico apropriado. Isso garante que as bactérias mantenham o plasmídeo e produzam quantidade suficiente para extração.
- Colheita e Lise Celular
A cultura bacteriana é centrifugada para sedimentar as células. O sedimento é ressuspenso em um tampão contendo RNase (para digerir RNA) e então tratado com uma solução de lise alcalina contendo SDS e hidróxido de sódio. Isso rompe as células e desnatura o DNA.
- Neutralização
Um tampão de neutralização contendo acetato de potássio é adicionado. A alta concentração de sal faz com que o DNA cromossômico desnaturado e as proteínas precipitem, enquanto o DNA plasmidial menor e superenrolado permanece em solução. A mistura é centrifugada, e o sobrenadante contendo o plasmídeo é coletado.
- Ligação e Lavagem
O sobrenadante é passado através de uma coluna de membrana de sílica em condições que fazem o DNA plasmidial se ligar. Um tampão de lavagem remove contaminantes restantes como sais, proteínas e RNA.
- Eluição
O DNA plasmidial purificado é liberado da membrana usando um tampão de baixa concentração salina ou água. O DNA resultante é puro o suficiente para sequenciamento, digestão por restrição ou transfecção de células eucarióticas.
