Die Sanger-Sequenzierung, auch Kettenabbruchsequenzierung genannt, ist eine Methode zur Bestimmung der genauen Reihenfolge von Nukleotiden in einem DNA-Molekül. Es wurde 1977 von Frederick Sanger entwickelt und ist nach wie vor der Goldstandard für die Validierung von DNA-Sequenzen und den Nachweis von Mutationen.
So funktioniert die Sanger-Sequenzierung
- Einrichten der Reaktion
Die zu sequenzierende DNA wird mit einem DNA-Primer, DNA-Polymerase, normalen Nukleotiden (dNTPs) und einer kleinen Menge fluoreszenzmarkierter Didesoxynukleotide (ddNTPs) gemischt. Jedes der vier ddNTPs ist mit einem anderen Fluoreszenzfarbstoff markiert.
- Kettenabbruch
Die Reaktion beginnt mit der Bindung des Primers an die Matrizen-DNA. Die DNA-Polymerase verlängert den Primer durch Hinzufügen von dNTPs. Immer wenn ein ddNTP anstelle eines dNTP eingebaut wird, stoppt das Kettenwachstum, da den ddNTPs die 3’-Hydroxylgruppe fehlt, die für eine weitere Verlängerung erforderlich ist.
- Fragmentgenerierung
Bei diesem Prozess entsteht eine Mischung aus DNA-Fragmenten unterschiedlicher Länge, die jeweils an einer bestimmten Nukleotidposition enden. Die fluoreszierende Markierung auf dem terminierenden ddNTP identifiziert, welche Base sich am Ende jedes Fragments befindet.
- Kapillarelektrophorese
Die Mischung wird in ein Kapillarelektrophorese-Instrument geladen, wo eine größenbasierte Trennung durch Kapillargelelektrophorese durchgeführt wird. Die Fragmente wandern durch eine Polymermatrix innerhalb der Kapillare und werden beim Passieren des Detektionsfensters durch laserinduzierte Fluoreszenz nachgewiesen. Ein Laser regt die fluoreszierenden Markierungen an und ein Detektor zeichnet auf, welche Farbe zu jedem Zeitpunkt vorbeikommt.
- Chromatogrammanalyse
Das Instrument erzeugt ein Chromatogramm – eine Reihe farbiger Peaks, die die Nukleotidsequenz darstellen. Die Sequenz wird aus dem Chromatogramm abgelesen, typischerweise vom kürzesten bis zum längsten Fragment, was die vollständige DNA-Sequenz ergibt.
Praktischer Sanger-Sequenzierungs-Workflow
Bereiten Sie die Template-DNA vor, indem Sie das PCR-Produkt oder Plasmid mit einem Säulenreinigungskit reinigen. Verwenden Sie für die Plasmidsequenzierung 200–500 ng gereinigtes Plasmid; Verwenden Sie für PCR-Produkte 1–10 ng pro 100 bp Amplikon. Richten Sie die Zyklussequenzierungsreaktion in einem 10-µL-Volumen ein: 2 µL BigDye Terminator v3.1 Ready Reaction Mix, 2 µL 5× Sequenzierungspuffer, 1 µL Primer (3,2 pmol/µL), Template-DNA und Wasser auf 10 µL. Verwenden Sie das folgende Temperaturwechselprogramm: 1 Minute bei 96 °C, dann 25 Zyklen mit 10 Sekunden bei 96 °C, 5 Sekunden bei 50 °C und 4 Minuten bei 60 °C. Reinigen Sie die Verlängerungsprodukte durch Ethanolfällung oder eine Reinigung mit Magnetkügelchen, um nicht eingebaute Farbstoffterminatoren zu entfernen. Laden Sie die gereinigte Probe auf ein Kapillarelektrophoresegerät (z. B. Applied Biosystems 3730). Der Lauf trennt Fragmente nach Größe und ein Laser regt die Fluoreszenzfarbstoffe an, wenn Fragmente das Detektionsfenster passieren. Untersuchen Sie das resultierende Chromatogramm mit Software wie FinchTV, SnapGene oder Chromas. Daten von guter Qualität erstrecken sich typischerweise 600–900 Basen vom Primer entfernt. Suchen Sie nach sauberen, gleichmäßig verteilten Peaks mit Basislinienauflösung. Einzelnukleotidpolymorphismen (SNPs) erscheinen als zwei überlappende Peaks an derselben Position. Schlechte Qualität am Anfang (erste 20–40 Basen) und am Ende (nach 800 Basen) ist normal – schneiden Sie diese Bereiche vor der Analyse ab. Beheben Sie fehlgeschlagene Reaktionen, indem Sie die Vorlage erhöhen, Primer mit einer Tm von 60–65 °C neu gestalten oder DMSO (2–5 %) für GC-reiche Vorlagen hinzufügen.
Reale Anwendung
Um ein CRISPR-editiertes Gen in Mäuseembryonen zu bestätigen, wird die Zielregion PCR-amplifiziert und Sanger-sequenziert. Das Chromatogramm zeigt gemischte Peaks in der Nähe der Schnittstelle, was auf Indels hinweist. Die ICE-Analyse zerlegt die Spur und zeigt eine Bearbeitungseffizienz von 72 % mit einer 1-bp-Insertion als häufigstem Allel. Aufgrund ihrer Genauigkeit und Kosteneffizienz bleibt die Sanger-Sequenzierung der Goldstandard für die Validierung von Genom-Editierungen.
