Die Sanger-Sequenzierung, auch Kettenabbruchsequenzierung genannt, ist eine Methode zur Bestimmung der genauen Reihenfolge von Nukleotiden in einem DNA-Molekül. Es wurde 1977 von Frederick Sanger entwickelt und ist nach wie vor der Goldstandard für die Validierung von DNA-Sequenzen und den Nachweis von Mutationen.
So funktioniert die Sanger-Sequenzierung
- Einrichten der Reaktion
Die zu sequenzierende DNA wird mit einem DNA-Primer, DNA-Polymerase, normalen Nukleotiden (dNTPs) und einer kleinen Menge fluoreszenzmarkierter Didesoxynukleotide (ddNTPs) gemischt. Jedes der vier ddNTPs ist mit einem anderen Fluoreszenzfarbstoff markiert.
- Kettenabbruch
Die Reaktion beginnt mit der Bindung des Primers an die Matrizen-DNA. Die DNA-Polymerase verlängert den Primer durch Hinzufügen von dNTPs. Immer wenn ein ddNTP anstelle eines dNTP eingebaut wird, stoppt das Kettenwachstum, da den ddNTPs die 3’-Hydroxylgruppe fehlt, die für eine weitere Verlängerung erforderlich ist.
- Fragmentgenerierung
Bei diesem Prozess entsteht eine Mischung aus DNA-Fragmenten unterschiedlicher Länge, die jeweils an einer bestimmten Nukleotidposition enden. Die fluoreszierende Markierung auf dem terminierenden ddNTP identifiziert, welche Base sich am Ende jedes Fragments befindet.
- Kapillarelektrophorese
Die Mischung wird in ein Kapillarelektrophoresegerät geladen. Die Fragmente werden bei ihrer Wanderung durch die Kapillare nach Größe getrennt. Ein Laser regt die fluoreszierenden Markierungen an und ein Detektor zeichnet auf, welche Farbe zu jedem Zeitpunkt vorbeikommt.
- Chromatogrammanalyse
Das Instrument erzeugt ein Chromatogramm – eine Reihe farbiger Peaks, die die Nukleotidsequenz darstellen. Die Sequenz wird aus dem Chromatogramm abgelesen, typischerweise vom kürzesten bis zum längsten Fragment, was die vollständige DNA-Sequenz ergibt.
