EMSA und DNA-Footprinting sind klassische Methoden zur Untersuchung von Protein-DNA-Wechselwirkungen. EMSA detektiert Bindung und misst Affinität, während Footprinting die spezifischen Nukleotide identifiziert, die von dem bindenden Protein kontaktiert werden.

Elektrophoretischer Mobilitätsverschiebungstest (EMSA)

EMSA, auch Gel-Retardationsassay genannt, beruht auf der Beobachtung, dass Protein-DNA-Komplexe langsamer durch ein natives Polyacrylamidgel wandern als freie DNA, ähnlich wie bei der Agarose-Gelelektrophorese. Eine radioaktiv oder fluoreszenzmarkierte DNA-Sonde, die die mutmaßliche Bindungsstelle enthält, wird mit einem Proteinextrakt oder gereinigtem Protein inkubiert. Das Gemisch wird durch native Gelelektrophorese aufgetrennt. Freie DNA läuft schneller, während proteingebundene DNA zu einer höheren Position im Gel verschoben ist.

EMSA ist hoch empfindlich und kann Wechselwirkungen in komplexen Gemischen nachweisen. Die Spezifität wird durch Kompetition mit unmarkierter spezifischer und unspezifischer DNA gezeigt. Überschüssige unmarkierte spezifische DNA eliminiert die verschobene Bande, während unspezifischer Kompetitor dies nicht tut. Supershift-Assays verwenden Antikörper gegen das bindende Protein, um den Komplex weiter zu verzögern und die Proteinidentität zu bestätigen.

Bindungsaffinität und Stöchiometrie

EMSA kann die Bindungsaffinität messen, indem die Proteinkonzentration titriert und der Anteil der gebundenen DNA quantifiziert wird. Die Gleichgewichtsdissoziationskonstante wird aus der Proteinkonzentration bei halbmaximaler Bindung bestimmt. Mehrere verschobene Banden können verschiedene stöchiometrische Komplexe oder mehrere Bindungsstellen anzeigen. Kooperative Bindung wird erkannt, wenn die Bindungskurve sigmoid statt hyperbolisch ist.

Sondendesign

DNA-Sonden für EMSA sind typischerweise 20 bis 40 Basenpaare lang und enthalten die Bindungsstelle. Doppelsträngige Sonden werden durch Annealing komplementärer Oligonukleotide und Endmarkierung mit radioaktivem Phosphor-32 oder Fluoreszenzfarbstoffen hergestellt. Längere Sonden von mehreren hundert Basenpaaren können zur Kartierung cis-regulatorischer Regionen verwendet werden. Biotin-markierte Sonden mit chemilumineszenzbasierter Detektion, wie beim Southern-Blot, bieten eine nicht-radioaktive Alternative.

DNase-I-Footprinting

DNase-I-Footprinting identifiziert die spezifischen Nukleotide, die durch ein gebundenes Protein geschützt werden. Ein an einem Ende markiertes DNA-Fragment wird mit dem bindenden Protein inkubiert und dann teilweise mit DNase I verdaut. Die Nuklease schneidet ungeschützte DNA stochastisch, während die proteingebundene Region vor Spaltung geschützt ist. Die Verdauungsprodukte werden durch denaturierende Gelelektrophorese neben einer Sequenzierleiter aufgetrennt.

Das Schutzmuster erscheint als Lücke in der Bandenleiter, der Footprint. Die Grenzen des Footprints definieren die Proteinbindungsstelle mit Nukleotidauflösung. Hypersensitive Stellen, an denen DNase I häufiger schneidet, werden oft an den Rändern des Footprints beobachtet und deuten auf eine durch Proteinbindung induzierte DNA-Krümmung hin.

Hydroxylradikal-Footprinting

Hydroxylradikal-Footprinting verwendet das hochreaktive Hydroxylradikal, um das DNA-Rückgrat an jeder Position mit geringer Sequenzabhängigkeit zu spalten. Das Radikal wird durch die Fenton-Reaktion mit Eisen-EDTA, Ascorbat und Wasserstoffperoxid erzeugt. Da das Radikal kleiner als DNase I ist, bietet das Hydroxylradikal-Footprinting eine höhere Auflösung und erkennt Kontakte auf einzelnen Nukleotidflächen. Es ist besonders nützlich für die Analyse der Periodizität von Protein-DNA-Wechselwirkungen entlang einer DNA-Helix.

In-vivo-Ansätze

In-vivo-Footprinting verwendet Agenzien, die DNA in lebenden Zellen modifizieren. Dimethylsulfat methyliert Guaninreste, die nicht durch gebundene Proteine geschützt sind. Nach der Behandlung wird DNA isoliert, an methylierten Stellen gespalten und mittels ligationsvermittelter PCR analysiert. Der Vergleich von In-vivo- und In-vitro-Mustern zeigt, welche Bindungsstellen in der Zelle besetzt sind. Chromatinzugänglichkeits-Assays wie DNase-seq und ATAC-seq bieten genomweite Ansichten von offenem Chromatin, jedoch mit geringerer Auflösung als Footprinting.

Anwendungen

EMSA wird verwendet, um vorhergesagte Transkriptionsfaktor-Bindungsstellen zu bestätigen, mutierte Bindungsstellen zu charakterisieren, kooperative Interaktionen zu untersuchen und die Bindungsaktivität während der Reinigung zu überwachen. Footprinting identifiziert die exakte DNA-Sequenz, die von einem Protein erkannt wird, und zeigt Konformationsänderungen, die durch Bindung induziert werden.

Einschränkungen

EMSA erfordert relativ stabile Komplexe, die der Elektrophorese standhalten. Schnell dissoziierende Komplexe werden möglicherweise nicht nachgewiesen. Die Gelmatrix kann schwache Wechselwirkungen stabilisieren, aber auch Artefakte durch Käfigeffekte erzeugen. Beide Techniken erfordern gereinigte DNA-Sonden und sind nicht für die Hochdurchsatzanalyse geeignet. Die quantitative EMSA erfordert eine sorgfältige Kontrolle der spezifischen Sondenaktivität und der Detektionslinearität.