Fluoreszenzspektroskopie ist eine Analysetechnik, die die Lichtemission von Molekülen nach Anregung durch Photonen misst. Es ist hochempfindlich (Nachweisgrenzen bis zu pM), selektiv und wird häufig in der Biochemie, Umweltanalytik und Materialwissenschaft eingesetzt.

Prinzipien der Fluoreszenz

Ein Molekül absorbiert ein Photon und wird vom Grundzustand (S0) in einen angeregten Singulettzustand (S1 oder S2) befördert. Durch die interne Umwandlung entspannt sich das Molekül schnell auf das niedrigste Schwingungsniveau von S1 (Kasha-Regel). Fluoreszenz tritt auf, wenn das Molekül durch Emission eines Photons zu S0 zurückkehrt und das emittierte Licht eine längere Wellenlänge (geringere Energie) als das absorbierte Licht hat, ein Phänomen, das als Stokes-Verschiebung bekannt ist. Diese Verschiebung entsteht durch Energieverlust durch Schwingungsrelaxation und Lösungsmittelreorganisation, und eine große Stokes-Verschiebung (20–100 nm) ermöglicht die Trennung von Anregungs- und Emissionslicht durch Filter oder Monochromatoren. Das Jablonski-Diagramm veranschaulicht diese photophysikalischen Prozesse: Absorption, interne Umwandlung, Fluoreszenz, Intersystem Crossing und Phosphoreszenz.

Fluoreszenzparameter

Zu den wichtigsten Fluoreszenzparametern gehören Quantenausbeute, Lebensdauer und Intensität. Die Quantenausbeute (Φ) ist das Verhältnis der emittierten Photonen zu den absorbierten Photonen (Φ = kemittiert/kabsorbiert), wobei die Werte von weniger als 0,01 (schwach fluoreszierend) bis nahe 1,0 (stark fluoreszierend, z. B. Fluorescein bei pH 9, Φ = 0,95) reichen. Die Lebensdauer (τ) ist die durchschnittliche Zeit, die ein Molekül im angeregten Zustand verbringt, bevor es ein Photon emittiert, typischerweise 1–10 ns für organische Fluorophore. Die Fluoreszenzintensität folgt I = I0 × (1 – 10-εbc) × Φ, wobei ε das molare Absorptionsvermögen, b die Weglänge und c die Konzentration ist; Bei niedrigen Konzentrationen ist die Intensität proportional zur Konzentration.

Fluorophore

Fluorophore werden in intrinsische und extrinsische Fluorophore eingeteilt. Intrinsische Fluorophore sind natürlich vorkommende fluoreszierende Moleküle wie aromatische Aminosäuren (Tryptophan, λex ~280 nm, λem ~350 nm), NADH, Flavine und Chlorophyll. Extrinsische Fluorophore sind synthetische Farbstoffe, die nicht fluoreszierenden Proben zugesetzt werden, darunter Fluorescein (λex 494 nm, λem 518 nm), Rhodamin, Cyaninfarbstoffe (Cy3, Cy5) und die Alexa Fluor-Serie. Quantenpunkte sind Halbleiter-Nanokristalle mit einstellbarer Emission, breiter Anregung, schmaler Emission und hoher Photostabilität.

Instrumentierung

Ein Fluoreszenzspektrometer umfasst eine Lichtquelle wie eine Xenon-Bogenlampe (breites Spektrum, 200–1000 nm) oder LEDs für stationäre Messungen und gepulste Laser oder LEDs für zeitaufgelöste Messungen. Ein Anregungsmonochromator wählt die Anregungswellenlänge aus und ein Doppelmonochromator reduziert Streulicht für hochempfindliche Messungen. Der Probenraum verwendet eine vierseitige Klarquarzküvette für die rechtwinklige Detektionsgeometrie oder eine Frontflächengeometrie für stark absorbierende oder streuende Proben. Ein Emissionsmonochromator scannt die Emissionswellenlänge, während ein Langpassfilter gestreutes Anregungslicht blockiert. Der Detektor ist typischerweise eine Photomultiplierröhre (PMT) für hohe Empfindlichkeit oder ein CCD für die Mehrkanaldetektion.

Fluoreszenztechniken

Es gibt mehrere spezielle Fluoreszenztechniken. Die stationäre Fluoreszenz misst die Emissionsintensität bei einer festen Anregungswellenlänge und wird zur Konzentrationsbestimmung und Emissionsspektralcharakterisierung verwendet. Zeitaufgelöste Fluoreszenz misst den Fluoreszenzabfall nach einem kurzen Anregungsimpuls und wird zur Bestimmung der Fluoreszenzlebensdauer, zur Unterscheidung dynamischer von statischer Löschung und zur Untersuchung der Molekulardynamik verwendet. Beim Fluoreszenzresonanzenergietransfer (FRET) handelt es sich um einen strahlungslosen Energietransfer von einem Donor-Fluorophor zu einem Akzeptor innerhalb von 1–10 nm mit einer Effizienz proportional zu 1/r6, was ihn zu einem molekularen Maßstab für Abstände in Proteinen und Nukleinsäuren macht. Die Fluoreszenzpolarisation (Anisotropie) misst die Rotationsmobilität von Fluorophoren und wird in Bindungsstudien und Immunoassays verwendet.

Abschrecken

Die Fluoreszenzlöschung kann durch zwei Mechanismen erfolgen. Dynamisches (Kollisions-)Löschen tritt auf, wenn ein Löschmittel wie O2, I- oder Acrylamid im angeregten Zustand zum Fluorophor diffundiert und mit diesem kollidiert, beschrieben durch die Stern-Volmer-Gleichung: F0/F = 1 + KSV[Q]. Statische Löschung erfolgt, wenn der Löscher mit dem Fluorophor einen nicht fluoreszierenden Grundzustandskomplex bildet. Die beiden Mechanismen werden durch Lebensdauermessungen unterschieden: Dynamisches Abschrecken verringert die Lebensdauer, statisches Abschrecken hingegen nicht.

Anwendungen

Die Fluoreszenzspektroskopie wird zur quantitativen Analyse fluoreszierender Analyten in pharmazeutischen und Umweltproben, Enzymaktivitätstests unter Verwendung fluorogener Substrate, DNA-Sequenzierung und Microarray-Analyse unter Verwendung fluoreszierender Markierungen, Zellbildgebung und Durchflusszytometrie unter Verwendung fluoreszierender Antikörper und Farbstoffe sowie der Umweltüberwachung von Schadstoffen wie polyzyklischen aromatischen Kohlenwasserstoffen und Huminstoffen verwendet.