Die Immunhistochemie ist eine mehrstufige Technik, bei der jede Variable das Endergebnis beeinflussen kann. Wenn die IHC versagt — sei es als schwache Färbung, übermäßiger Hintergrund oder unerwartete Muster — identifiziert ein systematischer Ansatz die Ursache. Strenge Kontrollen und Optimierungsprotokolle minimieren Fehler und gewährleisten zuverlässige diagnostische und prädiktive IHC.
Kontrollen: Das Fundament der IHC-Qualität
Jeder IHC-Durchlauf enthält drei wesentliche Kontrollen. Die Positivkontrolle ist ein Gewebe, das bekanntermaßen das Zielantigen in der erwarteten Intensität und subzellulären Lokalisation (nukleär, zytoplasmatisch oder membranös) exprimiert. Idealerweise wird die Positivkontrolle identisch zum Testgewebe prozessiert. Die Negativkontrolle ist das gleiche Positivkontrollgewebe, das ohne Primärantikörper prozessiert wird. Die interne Positivkontrolle ist ein nicht-neoplastischer Zelltyp im selben Schnitt, der das Zielantigen exprimieren sollte.
Schwache oder fehlende Färbung
Schwache oder fehlende Färbung bei Versagen der Positivkontrollen erfordert eine systematische Überprüfung. Gewebefixierung — Überfixierung (>72 Stunden) kann Antigene irreversibel maskieren; Unterfixierung (<4 Stunden) ermöglicht Antigendiffusion. Antigendemaskierung — HIER-Zeit oder -Temperatur erhöhen, auf einen Puffer mit höherem pH-Wert umsteigen oder enzymatische Demaskierung versuchen. Antikörper — Verfallsdatum, Einfrier-Auftau-Zyklen und Verdünnung überprüfen. Den Primärantikörper in Verdünnungsreihen titrieren. Detektionssystem — Sekundärantikörper muss zur Primärantikörper-Spezies passen; Chromogen (DAB) und Wasserstoffperoxid auf Frische prüfen.
Übermäßiger Hintergrund
Hintergrundfärbung kann die Interpretation unmöglich machen. Endogene Peroxidase (in Erythrozyten, Neutrophilen) wird durch Vorbehandlung mit 3% Wasserstoffperoxid blockiert. Endogenes Biotin (in Leber, Niere, Gehirn) verursacht Hintergrund bei Avidin-Biotin-Detektion — auf polymerbasierte Detektion umsteigen. Primärantikörper-Konzentration zu hoch — verdünnen, bis der Hintergrund verschwindet. Inkubationszeit oder -temperatur zu hoch — reduzieren (z.B. von 60 Min auf 30 Min bei RT). Unzureichendes Waschen — Waschpuffervolumen und -häufigkeit erhöhen. Eingetrocknete Schnitte — sicherstellen, dass Schnitte während aller Schritte mit Reagenz bedeckt bleiben.
Falsch-positive und falsch-negative Ergebnisse
Falsch-positive Ergebnisse können durch Antikörper-Kreuzreaktivität entstehen. Falsch-negative Ergebnisse resultieren meist aus unzureichender Antigendemaskierung oder Antigendegradation. Jeder neue Antikörper sollte durch einen Titer-Matrix-Test optimiert werden.
Automatisierte IHC-Validierung
Automatisierte IHC-Plattformen (Ventana, Dako, Leica) verbessern die Reproduzierbarkeit, erfordern aber eine Protokollvalidierung beim Übergang von manuellen Methoden. Ein Validierungssatz von mindestens 10 positiven und 10 negativen Fällen wird sowohl auf der manuellen als auch auf der automatisierten Plattform getestet. Eine Übereinstimmung von 90% wird typischerweise für die klinische Validierung gefordert.
