Überblick
Die Pathway-Anreicherungsanalyse bestimmt, ob vordefinierte Gensets, die biologische Signalwege, funktionelle Kategorien oder zelluläre Prozesse repräsentieren, in einer experimentell abgeleiteten Genliste statistisch überrepräsentiert sind. Dieser Ansatz verwandelt eine lange Liste differenziell exprimierter Gene in interpretierbare biologische Themen und hilft Forschern, von “welche Gene haben sich verändert?” zu “welche Prozesse sind betroffen?” überzugehen. Das Kernprinzip ist, dass, wenn ein Signalweg für die untersuchte Bedingung relevant ist, mehr seiner Mitgliedsgene in der Genliste des Benutzers erscheinen, als zufällig zu erwarten wäre.
Methoden
Zu den am weitesten verbreiteten Methoden gehören der exakte Fisher-Test (oder hypergeometrische Test), der die Überlappung zwischen der Genliste und einem Pathway-Genset gegen einen definierten Hintergrund bewertet. Die Gene Set Enrichment Analysis (GSEA) vermeidet willkürliche Signifikanzschwellen, indem sie alle Gene nach einer Metrik der differentiellen Expression ordnet und testet, ob Pathway-Mitglieder am oberen oder unteren Ende der geordneten Liste clusteren. Die Korrektur für multiples Testen, typischerweise die Benjamini-Hochberg-Falscherkennungsrate, ist unerlässlich, da Hunderte von Signalwegen gleichzeitig bewertet werden. Kuratierte Pathway-Datenbanken wie KEGG, Reactome und Gene Ontology liefern die Referenz-Gensets.
Anwendungen
Die Pathway-Anreicherung ist ein routinemäßiger Schritt in Transkriptomik-, Proteomik- und Metabolomik-Studien. Sie verknüpft Ergebnisse differentieller Expression aus DNA-Microarray- und Genexpressions-Experimenten mit funktioneller Biologie. Krebsforscher nutzen sie, um deregulierte Signalwege wie die Glykolyse oder den Citratzyklus zu identifizieren, und sie zeigt, wie Genregulation und Epigenetik zelluläre Programme bei Krankheiten umverdrahten. Die Anreicherungsanalyse leitet auch die Biomarkerentdeckung, indem sie Signalwege hervorhebt, die bei Stoffwechselwegen gemeinsam sind und in Patientenproben gestört sind.
Praktisches Protokoll
Für die Überrepräsentationsanalyse (ORA) mit clusterProfiler in R beginnen Sie mit einer Liste differentiell exprimierter Gene (z. B. padj < 0,05, |log2FC| > 1). Laden Sie das Paket und führen Sie die GO-Anreicherung durch: library(clusterProfiler); ego <- enrichGO(gene = de_genes, OrgDb = org.Hs.eg.db, keyType = "SYMBOL", ont = "BP", pAdjustMethod = "BH", pvalueCutoff = 0.05, qvalueCutoff = 0.2). Der ont-Parameter kann “BP” (Biologischer Prozess), “MF” (Molekulare Funktion) oder “CC” (Zelluläre Komponente) sein. Für die KEGG-Pathway-Anreicherung konvertieren Sie Gensymbole in Entrez-IDs: ekegg <- enrichKEGG(gene = entrez_ids, organism = "hsa", pvalueCutoff = 0.05). Visualisieren Sie Ergebnisse mit dotplot(ego, showCategory = 20), das das Genverhältnis, den adjustierten p-Wert und die Genanzahl pro Kategorie anzeigt. Die barplot-Funktion bietet eine alternative Ansicht. Für die Gen-Set-Anreicherungsanalyse (GSEA) bereiten Sie eine nach log2-Faltenänderung sortierte, geordnete Genliste vor: genelist <- sort(results$log2FoldChange, decreasing = TRUE); names(genelist) <- rownames(results). Führen Sie GSEA mit gseGO(geneList = genelist, OrgDb = org.Hs.eg.db, keyType = "SYMBOL", ont = "BP", minGSSize = 10, maxGSSize = 500, pvalueCutoff = 0.05) aus. GSEA benötigt keine Signifikanzschwelle und ist daher empfindlich für koordinierte, aber moderate Änderungen über Pathway-Mitglieder hinweg. Die Funktion gseaplot2 visualisiert den laufenden Anreicherungsscore für einen bestimmten Signalweg. Für die webbasierte Analyse verwenden Sie Enrichr: Fügen Sie eine Genliste unter https://maayanlab.cloud/Enrichr ein, wählen Sie Bibliotheken (KEGG, GO, WikiPathways) aus und laden Sie die Tabelle mit den kombinierten Scores herunter. Der kombinierte Score ist das Produkt aus dem log-transformierten p-Wert und dem z-Score und ordnet die Signalwege sowohl nach Signifikanz als auch nach Änderungsrichtung. Exportieren Sie Ergebnisse immer als CSV mit Spalten für Pathway-ID, Beschreibung, Genverhältnis, p-Wert, adjustierten p-Wert und die Liste der überlappenden Gene.
