Quantitative PCR (qPCR), auch Echtzeit-PCR genannt, ist eine Labortechnik, die DNA in Echtzeit amplifiziert und gleichzeitig quantifiziert. Im Gegensatz zur herkömmlichen PCR, die nur die endgültige DNA-Menge anzeigt, überwacht qPCR die Ansammlung von DNA während der Reaktion mithilfe von Fluoreszenz.
Wie qPCR funktioniert
- Reaktionsaufbau
Die Reaktion enthält die gleichen Komponenten wie herkömmliche PCR – Matrizen-DNA, Primer, DNA-Polymerase und Nukleotide – sowie einen fluoreszierenden Reporter. Zwei gängige Reportersysteme sind SYBR Green, ein Farbstoff, der fluoresziert, wenn er an doppelsträngige DNA gebunden wird, und TaqMan-Sonden, bei denen es sich um sequenzspezifische Fluoreszenzsonden handelt.
- Amplifikation und Detektion
Die Reaktion durchläuft die gleichen thermischen Zyklen wie die Standard-PCR: Denaturierung, Annealing und Verlängerung. Nach jedem Zyklus wird eine Fluoreszenzmessung durchgeführt. Je mehr DNA amplifiziert wird, desto größer wird das Fluoreszenzsignal.
- Der Ct-Wert
Der Schwellenwertzyklus (Ct) ist die Zykluszahl, bei der das Fluoreszenzsignal über den Hintergrundwert ansteigt. Der Ct-Wert ist umgekehrt proportional zur Ausgangsmenge an Ziel-DNA: Mehr Ausgangs-DNA bedeutet, dass weniger Zyklen erforderlich sind, um den Schwellenwert zu erreichen.
- Quantifizierung
Bei der absoluten Quantifizierung wird eine Standardkurve bekannter DNA-Konzentrationen verwendet, um die genaue Menge an Ziel-DNA zu berechnen. Bei der relativen Quantifizierung werden die Ct-Werte eines Zielgens mit denen eines Referenzgens verglichen und so die Faltungsänderungen in der Expression bestimmt.
- Schmelzkurvenanalyse
Bei Verwendung von SYBR Green wird nach der Amplifikation eine Schmelzkurvenanalyse durchgeführt. Die DNA wird langsam erhitzt, während die Fluoreszenz überwacht wird. Jedes DNA-Produkt schmilzt bei einer charakteristischen Temperatur und bestätigt so, dass das richtige Amplikon produziert wurde und keine Primer-Dimere vorhanden sind.
