Übersicht
Bei der Sequenzassemblierung handelt es sich um den rechnerischen Prozess der Rekonstruktion eines vollständigen Genoms oder Transkriptoms aus Millionen oder Milliarden kurzer DNA-Fragmente, die von Sequenzierern produziert werden. Da Sequenzierungsmaschinen jeweils nur 150–300 Basenpaare lesen, müssen Assemblierungsalgorithmen Überlappungen zwischen Lesevorgängen finden, diese zu längeren zusammenhängenden Sequenzen (Contigs) zusammenführen und Contigs in Gerüsten anordnen. Die Schwierigkeit der Assemblierung nimmt mit der Genomgröße, dem repetitiven Inhalt und der Heterozygotie zu. Die Qualität der Baugruppe wird anhand von Kennzahlen wie N50 (die Contig-Länge, bei der 50 % der Baugruppe abgedeckt ist) und der Gesamtzahl der Contigs gemessen.
Methoden
Es gibt zwei Hauptparadigmen für die Versammlung. Overlap-Layout-Consensus (OLC), der von Canu und Flye für lange Lesevorgänge verwendet wird, berechnet alle paarweisen Überlappungen zwischen Lesevorgängen, erstellt ein Diagramm und löst Pfade auf, um eine Konsenssequenz zu erzeugen. De-Bruijn-Graph-Assembler wie SPAdes und Velvet zerlegen Lesevorgänge in k-mers und erstellen einen Graphen, in dem k-mers Knoten sind und Kanten k-1-Überlappungen darstellen; Dieser Ansatz lässt sich effizient auf große Genome mit hoher Abdeckung skalieren. Hybrid-Assembler kombinieren die Genauigkeit kurzer Lesevorgänge mit den weitreichenden Informationen langer Lesevorgänge, um sich wiederholende Bereiche aufzulösen. Metagenomische Assembler wie MEGAHIT bewältigen gemischte mikrobielle Gemeinschaften, indem sie unterschiedliche Bedeckungstiefen zwischen den Arten berücksichtigen.
Anwendungen
Die De-novo-Genomassemblierung erzeugt Referenzgenome für neu sequenzierte Organismen, einschließlich Bakterien, Pflanzen und Wirbeltieren. In Projekten zur Sequenzierung der nächsten Generation (/guides/next-generation-sequencing.html) ist die Assemblierung der erste Schritt vor der Annotation und Analyse. Die Transkriptomassemblierung aus DNA-Sequenzierung-Lesevorgängen zeigt alternativ gespleißte Isoformen. Rekombinante DNA-Technologie verwendet Assemblierung, um Plasmidkonstrukte durch Assemblierung von Sanger-Sequenzierungsablesungen geklonter Inserts zu verifizieren.
Praktisches Protokoll
Beginnen Sie für die Sanger-Sequenzierungsassemblierung mit Phred/Phrap/Consed mit rohen ABI-Trace-Dateien (.ab1). Der Basisaufruf mit Phred konvertiert Traces in hochwertige Sequenzen mit Qualitätsbewertungen pro Basis: „phred -id seqs_dir -qd seqs_phd_dir -sd seqs_fasta_dir“. Phred meldet Qualitätswerte auf der Phred-Skala (-10 × log₁₀(error_probability)), wobei Q20 = 99 % Genauigkeit und Q30 = 99,9 % Genauigkeit. Assemblieren Sie Lesevorgänge mit Phrap: phrap seqs_fasta_dir/*.fasta -ace >assembly.log. Phrap verwendet einen gebänderten Smith-Waterman-Algorithmus mit Qualitätsbewertungen, um Konsenssequenzen zu berechnen und Lesevorgänge zu Contigs zusammenzusetzen. Sehen Sie sich die Assembly in Consed an und bearbeiten Sie sie manuell: „consed -acephap ace_file“. Consed zeigt ausgerichtete Lesevorgänge mit Farbcodierung in Basisqualität an, hebt Abweichungen hervor und ermöglicht die manuelle Bearbeitung des Konsenses. Navigieren Sie zu Problembereichen, die von Phrap als Abweichungen hoher Qualität (rote Balken) oder Regionen niedriger Qualität (blaue Hervorhebungen) gekennzeichnet sind. Beheben Sie Diskrepanzen manuell, indem Sie die Chromatogramme für jeden Messwert untersuchen, Enden mit geringer Qualität kürzen und falsch aufgerufene Basen korrigieren. Generieren Sie eine endgültige qualitätsgeprüfte Konsenssequenz: Datei → Konsens exportieren. Für die De-novo-Assemblierung eines kleinen Bakteriengenoms aus Illumina-Lesevorgängen verwenden Sie SPAdes mit der Flagge „–isolate“ für Einzelstammdaten. Bewerten Sie die Vollständigkeit der Baugruppe mit QUAST durch Berechnung des N50-, L50- und GC-Gehalts. Ordnen Sie zum Abschluss Contigs mit CONTIGUATOR anhand einer eng verwandten Referenz an und schließen Sie dann Lücken, indem Sie Primer über Contig-Enden für PCR und Sanger-Sequenzierung entwerfen. Überprüfen Sie die Endmontage, indem Sie die Lesevorgänge mit BWA-MEM abgleichen und die Einheitlichkeit der Abdeckung überprüfen.
