La electroforesis en gel de agarosa es una técnica de laboratorio fundamental que se utiliza para separar fragmentos de ADN en función de su tamaño. Cuando los científicos necesitan analizar el ADN después de la digestión de restricción, PCR o la purificación, recurren a la electroforesis en gel para visualizar los resultados. Si bien los geles de agarosa en placa siguen siendo el estándar para el análisis de ADN de rutina, la electroforesis en gel capilar (CGE) ofrece una alternativa automatizada y de alto rendimiento con detección de fluorescencia inducida por láser, ampliamente utilizada en la elaboración de perfiles de ADN forense y la secuenciación de ADN.

Cómo funciona la electroforesis en gel de agarosa

La técnica se basa en el hecho de que el ADN está cargado negativamente y migrará hacia un electrodo positivo cuando se coloque en un campo eléctrico.

1. Preparando el gel

El polvo de agarosa se mezcla con tampón TAE o TBE (normalmente 1× TAE o 0,5× TBE) y se calienta hasta que se disuelva. La agarosa fundida se vierte en una bandeja de fundición con un peine insertado para crear pocillos. A medida que se enfría, se solidifica formando una matriz de gel porosa.

2. Cargando las muestras

Las muestras de ADN se mezclan con un tinte de carga que contiene glicerol (para que se hundan) y tintes de seguimiento (para controlar la migración). Las muestras se pipetean en los pocillos del gel. En el primer pocillo se carga una escalera de ADN (una mezcla de fragmentos con tamaños conocidos) como referencia de tamaño.

3. Electroforesis

Se aplica una corriente eléctrica a través del gel. Como el ADN tiene carga negativa, los fragmentos se mueven a través del gel hacia el electrodo positivo. Los fragmentos más pequeños navegan por los poros del gel con facilidad y viajan rápidamente, mientras que los fragmentos más grandes se mueven más lentamente. Con el tiempo, los fragmentos se separan en bandas distintas según su tamaño.

4. Visualización

Después de la electroforesis, el gel se tiñe con un tinte que se une al ADN, como bromuro de etidio o SYBR Safe. Cuando se coloca bajo luz ultravioleta, el tinte emite fluorescencia y revela las bandas de ADN. Comparando las posiciones de las bandas con la escalera del ADN, los científicos pueden determinar el tamaño de cada fragmento.

Protocolo práctico de electroforesis en gel

Seleccione el porcentaje de agarosa en función de los tamaños de fragmento esperados: 0,7% para 0,8 a 10 kb, 1,0% para 0,5 a 5 kb, 1,5% para 0,2 a 3 kb y 2,0% para 0,1 a 1 kb. Pese la cantidad adecuada de agarosa (por ejemplo, 1 g para un gel al 1%) y agregue 100 ml de tampón TAE 1x. Calienta en el microondas hasta que la agarosa se disuelva por completo; remueve cada 30 segundos para evitar el sobrecalentamiento. Enfriar a ~60°C, añadir 5 ml de GelGreen o bromuro de etidio (10 mg/ml), mezclar y verter en una bandeja de fundición con el peine insertado. Deje solidificar durante 20 a 30 minutos. Coloque el gel en el tanque de electroforesis lleno de 1× TAE. Mezcle 5 l de cada muestra de ADN con 1 l de tinte de carga 6x (que contiene glicerol y azul de bromofenol). Cargue todo el volumen en un pozo. Cargue 5 l de una escalera de ADN Plus de 1 kb en el primer y último pocillo. Ejecute a 5–10 V/cm (medido como distancia entre electrodos); para un gel de 10 cm, lo típico es 80–100 V. Ejecute hasta que el frente del tinte azul de bromofenol haya migrado aproximadamente dos tercios de la longitud del gel (30 a 60 minutos). Visualice en un transiluminador UV (302 nm para bromuro de etidio, 470 nm para GelGreen) y fotografíe. Para aplicaciones posteriores (extracción de gel), utilice un UV de longitud de onda larga (365 nm) para minimizar el daño al ADN.

Aplicación del mundo real

Después de amplificar por PCR un fragmento de gen de 1,5 kb, se procesan 5 µl de producto en un gel de agarosa al 1% junto a una escalera de 1 kb. Una única banda brillante de 1,5 kb confirma una amplificación exitosa sin dímero de cebador ni productos inespecíficos. Se fotografía el gel y se corta la banda bajo luz ultravioleta para su purificación y clonación.