La cuantificación de proteínas es el proceso de determinar la concentración de proteínas en una solución. La cuantificación precisa de proteínas es esencial para muchas aplicaciones posteriores, incluidas SDS-PAGE, Western blotting, ensayos enzimáticos y estudios estructurales.
Métodos comunes de cuantificación de proteínas
Ensayo de Bradford
El ensayo de Bradford se basa en la unión del colorante Coomassie Brilliant Blue G-250 a proteínas. El tinte cambia de marrón a azul cuando se une a una proteína, y el máximo de absorbancia cambia de 465 nm a 595 nm. El ensayo es rápido, sencillo y compatible con la mayoría de los tampones. Es menos preciso en presencia de detergentes.
Ensayo BCA
El ensayo del ácido bicinconínico (BCA) se basa en la reducción de Cu2+ a Cu1+ mediante proteínas en un medio alcalino. Luego, BCA quela el Cu1+, formando un color púrpura que se absorbe a 562 nm. El ensayo BCA es más tolerante a los detergentes que el ensayo de Bradford pero es menos compatible con los agentes reductores.
Ensayo de Lowry
El ensayo de Lowry combina la reacción de biuret (quelación del cobre) con el reactivo de Folin-Ciocalteu, que reacciona con residuos de tirosina y triptófano. Produce un color azul medido a 750 nm. Es sensible pero requiere sincronización cuidadosa y se ve afectado por muchas sustancias que interfieren.
Absorbancia UV (A280)
Las proteínas absorben la luz ultravioleta a 280 nm debido a los residuos de triptófano y tirosina. La absorbancia a 280 nm proporciona una estimación rápida y no destructiva de la concentración de proteínas. Es más preciso para proteínas puras con coeficientes de extinción conocidos.
Curva estándar
Todos los ensayos colorimétricos requieren una curva estándar. Se preparan y miden diluciones en serie de un estándar de proteína conocido, típicamente albúmina sérica bovina (BSA). La absorbancia de la muestra desconocida se compara con la curva estándar para calcular su concentración.
Protocolos prácticos de ensayo BCA y Bradford
Ensayo BCA: Prepare los estándares de BSA mediante dilución en serie en el mismo tampón que las muestras; un rango típico es de 25 a 2000 µg/ml (0, 25, 125, 250, 500, 750, 1000, 1500, 2000 µg/ml). Mezcle 25 l de cada estándar o muestra con 200 l de reactivo de trabajo BCA (relación 50:1 de reactivo A a reactivo B) en una placa de 96 pocillos. Incubar a 37°C durante 30 minutos. Enfriar a temperatura ambiente y medir la absorbancia a 562 nm. Ajustar una curva estándar cuadrática o lineal. El ensayo BCA es compatible con detergentes (SDS, Triton X-100) hasta un 5% pero es incompatible con agentes reductores (DTT, β-mercaptoetanol) > 1 mM. Ensayo de Bradford: Prepare estándares en el mismo rango (25–1000 µg/mL). Mezclar 10 l de estándar o muestra con 200 l de reactivo de Bradford (tinte Coomassie G-250 en ácido fosfórico y metanol). Incubar a temperatura ambiente durante 5 minutos. Mida la absorbancia a 595 nm. El ensayo de Bradford es rápido (2 minutos) y compatible con agentes reductores y quelantes (EDTA), pero se inhibe fuertemente con detergentes (>0,1% Triton X-100 o SDS). Para ambos ensayos, incluya espacios en blanco que contengan solo tampón. Cada estándar y muestra deben analizarse por duplicado o triplicado. Descartar lecturas con CV > 15%. Solucione los problemas de fondo alto diluyendo aún más la muestra, cambiando los ensayos (use Bradford si las muestras contienen agentes reductores, use BCA si las muestras contienen detergentes) o realice una precipitación con TCA/acetona para eliminar las sustancias que interfieren.
Aplicación del mundo real
Al cuantificar el lisado de proteínas de células de mamíferos extraídas en tampón RIPA (que contiene 1 % de Triton X-100 y 0,1 % de SDS), se prefiere el ensayo BCA al de Bradford. La curva estándar de 25 a 2000 µg/ml de BSA en tampón RIPA muestra R² = 0,996. El lisado desconocido da A562 = 0,45, correspondiente a 1250 µg/ml. Después de la dilución, se cargan 20 µg por carril para SDS-PAGE o para análisis mediante electroforesis en gel capilar.
