La PCR de transcripción inversa (RT-PCR) es una técnica utilizada para detectar y amplificar ARN. Combina dos pasos: transcripción inversa de ARN en ADN complementario (ADNc), seguida de amplificación PCR del ADNc. Esto permite a los científicos estudiar la expresión genética y detectar virus de ARN.
Cómo funciona la RT-PCR
- Extracción de ARN
El ARN total se extrae de la muestra y se trata con ADNasa para eliminar cualquier ADN genómico contaminante. La calidad y concentración del ARN se verifican antes de continuar.
- Transcripción inversa
El ARN se mezcla con la enzima transcriptasa inversa, cebadores aleatorios o cebadores oligo-dT y nucleótidos. La transcriptasa inversa utiliza el ARN como plantilla para sintetizar una cadena de ADN complementaria. Luego, la ARNasa H degrada el molde de ARN, dejando ADNc monocatenario.
- amplificación por PCR
Luego, el ADNc se utiliza como plantilla para la PCR estándar con cebadores específicos de genes. La PCR amplifica el ADNc, produciendo suficiente ADN para visualizarlo en un gel o cuantificarlo mediante qPCR.
- Detección
Los productos de PCR amplificados se analizan mediante electroforesis en gel de agarosa. La presencia de una banda del tamaño esperado confirma que el ARN objetivo estaba presente en la muestra original.
- Aplicaciones La RT-PCR se utiliza ampliamente para medir los niveles de expresión genética, detectar virus de ARN como el VIH y el SARS-CoV-2, validar datos de secuenciación de ARN y analizar empalmes alternativos. Cuando se combina con qPCR, se convierte en RT-qPCR, lo que permite la cuantificación del ARN en tiempo real.
Protocolo práctico de RT-PCR
Comience por extraer el ARN total utilizando una columna de sílice o un método basado en TRIzol. Evalúe la integridad del ARN mediante electroforesis en gel de agarosa o un bioanalizador: el ARN intacto muestra bandas ribosomales nítidas 28S y 18S con una proporción 28S:18S cercana a 2:1. Mida la concentración y la pureza mediante espectrofotometría UV (A260/A280 > 1,8, A260/A230 > 2,0). Trate de 1 a 5 µg de ARN con DNasa I a 37 °C durante 30 minutos y luego inactive con calor a 75 °C durante 10 minutos. Para la transcripción inversa, mezcle el ARN tratado con ADNasa con hexámeros aleatorios o cebadores oligo-dT (50–250 ng), dNTP 1 mM y 200 U de transcriptasa inversa en el tampón suministrado. Incubar a 25°C durante 10 minutos, 42°C durante 50 minutos y 70°C durante 15 minutos. Diluya el ADNc resultante entre 5 y 10 veces antes de la amplificación por PCR. Incluya siempre un control sin transcriptasa inversa (no-RT) para detectar contaminación del ADN genómico; si la muestra sin RT produce un producto de PCR, hay ADN residual. Para cebadores específicos de genes, diseñarlos para abarcar una unión exón-exón para evitar amplificar el ADN genómico; un cebador directo en un exón y un cebador inverso en un exón aguas abajo garantizan que sólo se amplifique el ADNc empalmado.
Aplicación del mundo real
En el diagnóstico del SARS-CoV-2, la RT-PCR se dirige a los genes virales N, E y RdRp utilizando conjuntos de cebadores y sondas de los CDC o la OMS. El ARN se extrae de hisopos nasofaríngeos y la RT-qPCR con sondas marcadas dualmente detecta el ARN viral en umbrales de ciclo (Ct) inferiores a 40. Un resultado positivo en dos de tres genes diana confirma la infección. La inclusión de un control interno (p. ej., RNasa P humana) verifica la idoneidad de la muestra y el éxito de la extracción, evitando falsos negativos debido a una recolección deficiente de la muestra.
