La PCR de transcripción inversa (RT-PCR) es una técnica utilizada para detectar y amplificar ARN. Combina dos pasos: la transcripción inversa del ARN en ADN complementario (ADNc), seguida de la amplificación por PCR del ADNc. Esto permite a los científicos estudiar la expresión génica y detectar virus de ARN.
Cómo funciona la RT-PCR
- Extracción de ARN
Se extrae el ARN total de la muestra y se trata con DNasa para eliminar cualquier ADN genómico contaminante. La calidad y concentración del ARN se verifican antes de continuar.
- Transcripción inversa
El ARN se mezcla con la enzima transcriptasa inversa, cebadores aleatorios o cebadores oligo-dT, y nucleótidos. La transcriptasa inversa utiliza el ARN como molde para sintetizar una cadena de ADN complementaria. Luego, el molde de ARN es degradado por la RNasa H, dejando ADNc de cadena simple.
- Amplificación por PCR
El ADNc se utiliza entonces como molde para la PCR estándar con cebadores específicos del gen. La PCR amplifica el ADNc, produciendo suficiente ADN para visualizar en un gel o cuantificar mediante qPCR.
- Detección
Los productos de PCR amplificados se analizan mediante electroforesis en gel de agarosa. La presencia de una banda del tamaño esperado confirma que el ARN diana estaba presente en la muestra original.
- Aplicaciones
La RT-PCR se utiliza ampliamente para medir niveles de expresión génica, detectar virus de ARN como el VIH y el SARS-CoV-2, validar datos de secuenciación de ARN y analizar el splicing alternativo. Cuando se combina con qPCR, se convierte en RT-qPCR, permitiendo la cuantificación en tiempo real del ARN.
