La PCR numérique (dPCR) est un perfectionnement de la PCR conventionnelle qui fournit une quantification absolue des acides nucléiques sans nécessiter de courbe standard. L’échantillon est partitionné en milliers de minuscules réactions individuelles, et après amplification, le nombre de partitions positives par rapport aux négatives est compté.
Comment Fonctionne la PCR Numérique
- Partitionnement
Le mélange PCR contenant l’échantillon, les amorces, la sonde et la polymérase est divisé en milliers de partitions de taille nanolitrique. Cela peut être fait en utilisant une puce avec des micro-puits, des gouttelettes dans une émulsion d’huile (PCR numérique en gouttelettes), ou d’autres méthodes. Chaque partition contient zéro ou au moins une copie de l’ADN cible.
- Amplification
L’échantillon partitionné subit un cyclage thermique standard. Dans chaque partition, la PCR se déroule indépendamment. Les partitions contenant l’ADN cible produisent un produit amplifié, tandis que les partitions vides n’en produisent pas.
- Détection en Point Final
Après amplification, chaque partition est analysée pour la fluorescence. Les partitions contenant l’ADN cible amplifié sont marquées comme positives (fluorescentes), tandis que celles sans sont marquées comme négatives. Aucun cycle de quantification (Ct) n’est nécessaire — il s’agit simplement d’une lecture oui/non par partition.
- Statistiques de Poisson
Étant donné que le partitionnement est aléatoire, certaines partitions peuvent contenir plusieurs copies de la cible. Les statistiques de Poisson sont utilisées pour calculer le nombre absolu de molécules cibles dans l’échantillon d’origine en fonction de la proportion de partitions négatives.
- Applications
La PCR numérique est très précise et est utilisée pour quantifier les mutations rares, détecter les pathogènes en faible abondance, analyser les variations du nombre de copies et vérifier les résultats du NGS. Elle est moins sensible aux inhibiteurs de PCR que la qPCR et fournit une quantification absolue sans étalons.
