L’EMSA et l’empreinte ADN sont des méthodes classiques pour étudier les interactions protéine-ADN. L’EMSA détecte la liaison et mesure l’affinité, tandis que l’empreinte ADN identifie les nucléotides spécifiques qui sont contactés par la protéine de liaison.

Test de décalage de mobilité électrophorétique

L’EMSA, également appelé test de décalage sur gel, est basé sur l’observation que les complexes protéine-ADN migrent plus lentement dans un gel de polyacrylamide natif que l’ADN libre, similaire à l’électrophorèse sur gel d’agarose. Une sonde d’ADN marquée radioactivement ou par fluorescence contenant le site de liaison putatif est incubée avec un extrait protéique ou une protéine purifiée. Le mélange est séparé par électrophorèse sur gel natif. L’ADN libre migre plus vite, tandis que l’ADN lié à la protéine est décalé vers une position plus haute dans le gel.

L’EMSA est très sensible et peut détecter des interactions dans des mélanges complexes. La spécificité est démontrée par compétition avec de l’ADN non marqué spécifique et non spécifique. Un excès d’ADN spécifique non marqué élimine la bande décalée, tandis que le compétiteur non spécifique ne le fait pas. Les tests de super-décalage utilisent des anticorps contre la protéine de liaison pour retarder davantage le complexe, confirmant l’identité de la protéine.

Affinité et stœchiométrie de liaison

L’EMSA peut mesurer l’affinité de liaison en titrant la concentration de protéine et en quantifiant la fraction d’ADN lié. La constante de dissociation à l’équilibre est déterminée à partir de la concentration de protéine à demi-saturation. De multiples bandes décalées peuvent révéler différents complexes stœchiométriques ou plusieurs sites de liaison. La liaison coopérative est détectée lorsque la courbe de liaison est sigmoïdale plutôt qu’hyperbolique.

Conception des sondes

Les sondes d’ADN pour l’EMSA mesurent généralement 20 à 40 paires de bases contenant le site de liaison. Les sondes double brin sont préparées par hybridation d’oligonucléotides complémentaires et marquage à l’extrémité avec du phosphore-32 radioactif ou des colorants fluorescents. Des sondes plus longues de plusieurs centaines de paires de bases peuvent être utilisées pour cartographier les régions cis-régulatrices. Les sondes marquées à la biotine avec détection chimiluminescente, comme utilisées dans le Southern blot, fournissent une alternative non radioactive.

Empreinte à la DNase I

L’empreinte à la DNase I identifie les nucléotides spécifiques protégés par une protéine liée. Un fragment d’ADN marqué à une extrémité est incubé avec la protéine de liaison, puis partiellement digéré avec la DNase I. La nucléase coupe l’ADN non protégé de manière stochastique, mais la région liée à la protéine est protégée du clivage. Les produits de digestion sont séparés par électrophorèse sur gel dénaturant parallèlement à un marqueur de séquence.

Le profil de protection apparaît comme un trou dans l’échelle des bandes, l’empreinte. Les limites de l’empreinte définissent le site de liaison de la protéine à résolution nucléotidique. Les sites hypersensibles, où la DNase I coupe plus fréquemment, sont souvent observés aux bords de l’empreinte et indiquent une courbure de l’ADN induite par la liaison protéique.

Empreinte au radical hydroxyle

L’empreinte au radical hydroxyle utilise le radical hydroxyle hautement réactif pour cliver le squelette de l’ADN à chaque position avec peu de biais de séquence. Le radical est généré par la réaction de Fenton utilisant le fer-EDTA, l’ascorbate et le peroxyde d’hydrogène. Parce que le radical est plus petit que la DNase I, l’empreinte au radical hydroxyle fournit une résolution plus élevée, détectant les contacts sur des faces nucléotidiques individuelles. Elle est particulièrement utile pour analyser la périodicité des interactions protéine-ADN le long d’une hélice d’ADN.

Approches in vivo

L’empreinte in vivo utilise des agents qui modifient l’ADN dans les cellules vivantes. Le diméthylsulfate méthyle les résidus guanine qui ne sont pas protégés par des protéines liées. Après traitement, l’ADN est isolé, clivé aux sites méthylés et analysé par PCR couplée à la ligation. La comparaison des profils in vivo et in vitro révèle quels sites de liaison sont occupés dans la cellule. Les tests d’accessibilité de la chromatine tels que la DNase-seq et l’ATAC-seq fournissent des vues pangénomiques de la chromatine ouverte mais à une résolution plus faible que l’empreinte.

Applications

L’EMSA est utilisé pour confirmer les sites de liaison prédits des facteurs de transcription, caractériser les sites de liaison mutants, étudier les interactions coopératives et surveiller l’activité de liaison pendant la purification. L’empreinte identifie la séquence d’ADN exacte reconnue par une protéine et révèle les changements conformationnels induits par la liaison.

Limites

L’EMSA nécessite des complexes relativement stables qui survivent à l’électrophorèse. Les complexes à dissociation rapide peuvent ne pas être détectés. La matrice du gel peut stabiliser les interactions faibles mais aussi créer des artéfacts par effet de cage. Les deux techniques nécessitent des sondes d’ADN purifiées et ne sont pas adaptées à l’analyse haut débit. L’EMSA quantitatif nécessite un contrôle minutieux de l’activité spécifique de la sonde et de la linéarité de la détection.