La chromatographie d’affinité réalise la séparation en exploitant les interactions biologiques réversibles hautement spécifiques entre un ligand (immobilisé sur la phase stationnaire) et une molécule cible dans la phase mobile. Cette technique offre une sélectivité inégalée, atteignant souvent des facteurs de purification de 1000 fois ou plus en une seule étape. La force de l’interaction est mesurée par la constante de dissociation K_d, les purifications par affinité réussies nécessitant généralement un K_d dans la gamme de 10⁻⁴ à 10⁻¹⁰ M.
Le ligand est immobilisé par covalence sur une matrice de support par l’intermédiaire d’un bras espaceur qui réduit l’encombrement stérique entre le ligand et la cible. Les ligands courants comprennent les anticorps (pour la chromatographie d’immunoaffinité), les lectines (pour la purification des glycoprotéines), les inhibiteurs enzymatiques (pour l’isolement des enzymes) et les ions métalliques tels que Ni²⁺ ou Co²⁺ (pour la chromatographie d’affinité sur métal immobilisé, IMAC). La matrice de support doit être chimiquement stable, hydrophile pour minimiser les liaisons non spécifiques et disponible sous forme de billes avec une porosité contrôlée. L’agarose (par exemple, Sepharose 4B) est le support le plus utilisé, souvent réticulé pour une résistance mécanique accrue.
La séparation par affinité se déroule en trois étapes. Liaison : l’échantillon est chargé dans des conditions qui favorisent la formation du complexe (pH, force ionique et température optimisés). Lavage : les contaminants non liés et faiblement liés sont éliminés avec un tampon qui préserve l’interaction ligand-cible. Élution : la cible est libérée en perturbant l’interaction, généralement en utilisant l’une des trois approches. L’élution compétitive déplace la cible avec une concentration élevée de ligand libre ou d’un analogue structural. Le changement de pH modifie l’état d’ionisation des résidus de liaison (par exemple, glycine-HCl, pH 2,5). Le changement de force ionique perturbe les interactions électrostatiques (par exemple, gradient de NaCl). Les conditions d’élution doivent être soigneusement optimisées pour maintenir l’activité biologique de la cible.
La chromatographie d’affinité est indispensable dans la purification des protéines. La purification par étiquette His utilisant l’IMAC est la méthode la plus employée : une étiquette polyhistidine (généralement 6×His) sur la protéine recombinante se lie à l’agarose Ni²⁺-NTA et est éluée avec de l’imidazole. La purification par étiquette GST utilise du glutathion-agarose pour capturer les protéines de fusion avec la glutathion S-transférase. La purification d’anticorps avec la protéine A ou la protéine G agarose est une pierre angulaire de la recherche en immunologie, produisant des IgG de haute pureté à partir de sérum ou de surnageants de culture d’hybridomes. Au-delà des protéines, la chromatographie d’affinité est utilisée pour l’isolement d’enzymes (affinité aux lectines pour les glycoprotéines, NAD⁺-agarose pour les déshydrogénases) et pour la purification des acides nucléiques en utilisant de l’oligo-dT cellulose pour la capture des ARNm.
