La PCR quantitative (qPCR), également connue sous le nom de PCR en temps réel, est une technique de laboratoire qui amplifie et quantifie simultanément l’ADN en temps réel. Contrairement à la PCR conventionnelle, qui ne montre que la quantité finale d’ADN, la qPCR surveille l’accumulation d’ADN tout au long de la réaction en utilisant la fluorescence.
Comment fonctionne la qPCR
- Configuration de la réaction
La réaction contient les mêmes composants que la PCR conventionnelle (ADN modèle, amorces, ADN polymérase et nucléotides), plus un rapporteur fluorescent. Deux systèmes rapporteurs courants sont le SYBR Green, un colorant fluorescent lorsqu’il est lié à l’ADN double brin, et les sondes TaqMan, qui sont des sondes fluorescentes spécifiques à une séquence.
- Amplification et détection
La réaction subit le même cycle thermique que la PCR standard : dénaturation, recuit et extension. Après chaque cycle, une mesure de fluorescence est effectuée. À mesure que l’ADN est amplifié, le signal de fluorescence augmente proportionnellement.
- La valeur Ct
Le cycle seuil (Ct) est le numéro de cycle auquel le signal de fluorescence s’élève au-dessus du niveau de fond. La valeur Ct est inversement proportionnelle à la quantité initiale d’ADN cible : plus d’ADN initial signifie que moins de cycles sont nécessaires pour atteindre le seuil.
- Quantification
La quantification absolue utilise une courbe standard de concentrations d’ADN connues pour calculer la quantité exacte d’ADN cible. La quantification relative compare les valeurs Ct d’un gène cible à un gène de référence, déterminant ainsi les changements d’expression.
- Analyse de la courbe de fusion
Lorsque SYBR Green est utilisé, une analyse de la courbe de fusion est effectuée après amplification. L’ADN est chauffé lentement tandis que la fluorescence est surveillée. Chaque produit d’ADN fond à une température caractéristique, confirmant que l’amplicon correct a été produit et qu’aucun amorce-dimère n’est présent.
Protocole qPCR pratique
Préparer la réaction dans une plaque de 96 ou 384 puits. Pour SYBR Green, mélangez 5 µL de mélange maître 2 × SYBR Green, 0,5 µL de chaque amorce (10 µM), 2 µL d’ADNc ou d’ADN matrice et de l’eau jusqu’à 10 µL. Pour la détection basée sur la sonde, remplacez SYBR Green par un mélange maître de sonde 2 × et ajoutez 0,2 à 0,4 µM de chaque sonde. Scellez la plaque avec un film adhésif optique et centrifugez brièvement. Exécuter sur un cycleur en temps réel avec le programme suivant : 95°C pendant 2 minutes (activation de la polymérase), puis 40 cycles à 95°C pendant 15 secondes et 60°C pendant 30 à 60 secondes (recuit et extension). Recueillir des données de fluorescence à la fin de chaque étape d’extension. Après le cyclage, effectuez une rampe de courbe de fusion de 60°C à 95°C si vous utilisez SYBR Green. Pour une quantification absolue, préparez une courbe standard en diluant en série un modèle connu (10^7 à 10^2 copies/µL par étapes de 10). Tracez Ct par rapport au nombre de copies du journal et vérifiez que la pente est comprise entre -3,1 et -3,6 (efficacité de 90 à 110 %). Pour une quantification relative à l’aide de la méthode ΔΔCq, calculez ΔCt = Ct (cible) - Ct (référence), puis ΔΔCt = ΔCt (traité) - ΔCt (contrôle). Changement de pli = 2 ^ (−ΔΔCt). Incluez des contrôles sans modèle et sans RT pour les cibles basées sur l’ARN. Exécutez tous les échantillons en triple technique et jetez ceux dont l’écart type Ct est > 0,5.
Application du monde réel
Dans les études d’expression génique pour la recherche sur le cancer, la RT-qPCR avec SYBR Green quantifie les niveaux d’ARNm d’oncogènes tels que MYC et de suppresseurs de tumeurs comme TP53. GAPDH ou ACTB sert de gène de référence. L’ARN de la tumeur et des tissus normaux adjacents est transcrit de manière inverse et l’analyse ΔΔCq révèle que MYC est régulée positivement par 8,5 fois dans les tumeurs (p < 0,001). L’analyse de la courbe de fusion confirme la présence d’un seul produit à la Tm attendue, excluant les artefacts amorce-dimère.
