La PCR quantitative (qPCR), également connue sous le nom de PCR en temps réel, est une technique de laboratoire qui amplifie et quantifie simultanément l’ADN en temps réel. Contrairement à la PCR conventionnelle, qui montre seulement la quantité finale d’ADN, la qPCR surveille l’accumulation de l’ADN tout au long de la réaction en utilisant la fluorescence.
Comment Fonctionne la qPCR
- Configuration de la Réaction
La réaction contient les mêmes composants que la PCR conventionnelle — ADN matrice, amorces, ADN polymérase et nucléotides — plus un rapporteur fluorescent. Deux systèmes rapporteurs courants sont le SYBR Green, un colorant qui fluoresce lorsqu’il est lié à l’ADN double brin, et les sondes TaqMan, qui sont des sondes fluorescentes spécifiques à une séquence.
- Amplification et Détection
La réaction subit le même cyclage thermique que la PCR standard : dénaturation, hybridation et élongation. Après chaque cycle, une mesure de fluorescence est effectuée. À mesure que plus d’ADN est amplifié, le signal de fluorescence augmente proportionnellement.
- La Valeur Ct
Le cycle seuil (Ct) est le numéro de cycle auquel le signal de fluorescence dépasse le niveau de fond. La valeur Ct est inversement proportionnelle à la quantité initiale d’ADN cible : plus d’ADN de départ signifie moins de cycles nécessaires pour atteindre le seuil.
- Quantification
La quantification absolue utilise une courbe standard de concentrations d’ADN connues pour calculer la quantité exacte d’ADN cible. La quantification relative compare les valeurs Ct d’un gène cible à un gène de référence, déterminant les changements d’expression en plis.
- Analyse de la Courbe de Fusion
Lorsque le SYBR Green est utilisé, une analyse de la courbe de fusion est effectuée après l’amplification. L’ADN est lentement chauffé tandis que la fluorescence est surveillée. Chaque produit d’ADN fond à une température caractéristique, confirmant que le bon amplicon a été produit et qu’aucun amorce-dimère n’est présent.
