Le Western Blot (également appelé immunobuvardage de protéines) est une technique de laboratoire utilisée pour détecter une protéine spécifique dans un échantillon biologique complexe. Alors que le SDS-PAGE sépare les protéines par taille, il ne peut pas dire quelle protéine est laquelle — de nombreuses protéines différentes peuvent avoir le même poids. Le Western Blot résout ce problème en utilisant des anticorps qui agissent comme des missiles thermoguidés, se liant uniquement à la protéine spécifique qu’un scientifique souhaite étudier.
Comment Fonctionne le Western Blotting
Après que les protéines ont été séparées par SDS-PAGE, elles sont toujours piégées à l’intérieur du gel fragile. Le Western blotting les transfère vers une surface solide où elles sont détectées à l’aide d’anticorps.
- Transfert
Les protéines sont déplacées du gel de polyacrylamide vers une membrane mince et durable (généralement en nitrocellulose ou PVDF). En appliquant un champ électrique perpendiculaire au gel, les protéines sont poussées hors du gel et adhèrent fermement à la surface de la membrane, créant une réplique exacte du motif de séparation original.
- Blocage
La membrane est très collante et attrapera toute protéine qu’elle touche. Pour empêcher les anticorps de se coller aux espaces vides sur la membrane (ce qui créerait un fond sombre et sale), la membrane est trempée dans une solution de « blocage » — souvent un mélange de protéines diluées comme du lait écrémé en poudre ou de la sérumalbumine bovine (BSA).
- Incubation avec Anticorps
La membrane est traitée avec un anticorps primaire conçu pour reconnaître uniquement la protéine cible. Après avoir lavé les anticorps primaires non liés, un anticorps secondaire est ajouté. Ce second anticorps reconnaît le premier et est généralement attaché à une enzyme ou un colorant fluorescent qui agit comme un signal.
- Détection
Pour voir les résultats, un substrat chimique est ajouté qui réagit avec l’enzyme sur l’anticorps secondaire, produisant de la lumière (chimiluminescence) ou un dépôt coloré. Cela crée une bande sombre sur un morceau de film ou une image numérique, confirmant non seulement la taille de la protéine, mais aussi son identité exacte et sa quantité.
