EMSA dan footprinting DNA adalah metode klasik untuk mempelajari interaksi protein-DNA. EMSA mendeteksi pengikatan dan mengukur afinitas, sementara footprinting mengidentifikasi nukleotida spesifik yang dikontak oleh protein pengikat.

Uji Pergeseran Mobilitas Elektroforetik

EMSA, juga disebut uji pergeseran gel, didasarkan pada pengamatan bahwa kompleks protein-DNA bermigrasi lebih lambat melalui gel poliakrilamida asli daripada DNA bebas, mirip dengan elektroforesis gel agarosa. Probe DNA berlabel radioaktif atau fluoresen yang mengandung situs pengikatan yang diduga diinkubasi dengan ekstrak protein atau protein murni. Campuran dipisahkan oleh elektroforesis gel asli. DNA bebas berjalan lebih cepat, sementara DNA terikat protein bergeser ke posisi lebih tinggi dalam gel.

EMSA sangat sensitif dan dapat mendeteksi interaksi dalam campuran kompleks. Spesifisitas ditunjukkan oleh kompetisi dengan DNA spesifik dan non-spesifik tanpa label. DNA spesifik tanpa label berlebih menghilangkan pita yang bergeser, sementara kompetitor non-spesifik tidak. Uji supershift menggunakan antibodi terhadap protein pengikat untuk lebih memperlambat kompleks, mengonfirmasi identitas protein.

Afinitas Pengikatan dan Stoikiometri

EMSA dapat mengukur afinitas pengikatan dengan mentitrasi konsentrasi protein dan mengkuantifikasi fraksi DNA yang terikat. Konstanta disosiasi kesetimbangan ditentukan dari konsentrasi protein pada pengikatan setengah maksimal. Beberapa pita yang bergeser dapat mengungkapkan kompleks stoikiometri yang berbeda atau beberapa situs pengikatan. Pengikatan kooperatif dideteksi ketika kurva pengikatan sigmoidal daripada hiperbolik.

Desain Probe

Probe DNA untuk EMSA biasanya panjangnya 20 hingga 40 pasangan basa yang mengandung situs pengikatan. Probe untai ganda disiapkan dengan menganil oligonukleotida komplementer dan pelabelan ujung dengan fosfor-32 radioaktif atau pewarna fluoresen. Probe yang lebih panjang dari beberapa ratus pasangan basa dapat digunakan untuk memetakan daerah cis-regulatori. Probe berlabel biotin dengan deteksi kemiluminesen, seperti yang digunakan dalam Southern blot, menyediakan alternatif non-radioaktif.

Footprinting DNase I

Footprinting DNase I mengidentifikasi nukleotida spesifik yang dilindungi oleh protein terikat. Fragmen DNA yang dilabeli di satu ujung diinkubasi dengan protein pengikat dan kemudian dicerna sebagian dengan DNase I. Nuklease memotong DNA yang tidak terlindungi secara stokastik, tetapi daerah yang terikat protein dilindungi dari pembelahan. Produk digesti dipisahkan oleh elektroforesis gel denaturasi bersama dengan tangga pengurutan.

Pola perlindungan muncul sebagai celah di tangga pita, yaitu footprint. Batas footprint menentukan situs pengikatan protein pada resolusi nukleotida. Situs hipersensitif, di mana DNase I memotong lebih sering, sering terlihat di tepi footprint dan menunjukkan pembengkokan DNA yang diinduksi oleh pengikatan protein.

Footprinting Radikal Hidroksil

Footprinting radikal hidroksil menggunakan radikal hidroksil yang sangat reaktif untuk membelah tulang punggung DNA di setiap posisi dengan bias sekuens yang kecil. Radikal dihasilkan oleh reaksi Fenton menggunakan besi-EDTA, askorbat, dan hidrogen peroksida. Karena radikal lebih kecil dari DNase I, footprinting radikal hidroksil memberikan resolusi lebih tinggi, mendeteksi kontak pada muka nukleotida individu. Ini sangat berguna untuk menganalisis periodisitas interaksi protein-DNA di sepanjang heliks DNA.

Pendekatan In Vivo

Footprinting in vivo menggunakan agen yang memodifikasi DNA dalam sel hidup. Dimetil sulfat memetilasi residu guanin yang tidak dilindungi oleh protein terikat. Setelah perawatan, DNA diisolasi, dibelah di situs termetilasi, dan dianalisis oleh PCR yang dimediasi ligasi. Perbandingan pola in vivo dan in vitro mengungkapkan situs pengikatan mana yang ditempati dalam sel. Uji aksesibilitas kromatin seperti DNase-seq dan ATAC-seq memberikan pandangan seluruh genom tentang kromatin terbuka tetapi pada resolusi lebih rendah daripada footprinting.

Aplikasi

EMSA digunakan untuk mengonfirmasi situs pengikatan faktor transkripsi yang diprediksi, mengkarakterisasi situs pengikatan mutan, mempelajari interaksi kooperatif, dan memantau aktivitas pengikatan selama pemurnian. Footprinting mengidentifikasi sekuens DNA tepat yang dikenali oleh protein dan mengungkapkan perubahan konformasi yang diinduksi oleh pengikatan.

Keterbatasan

EMSA memerlukan kompleks yang relatif stabil yang bertahan dalam elektroforesis. Kompleks yang berdisosiasi cepat mungkin tidak terdeteksi. Matriks gel dapat menstabilkan interaksi lemah tetapi juga menciptakan artefak dari efek kurungan. Kedua teknik memerlukan probe DNA murni dan tidak cocok untuk analisis throughput tinggi. EMSA kuantitatif memerlukan kontrol yang cermat dari aktivitas spesifik probe dan linearitas deteksi.