Fiksasi adalah langkah pertama dan paling kritis dalam preservasi jaringan. Ini menghentikan pembusukan seluler, menstabilkan makromolekul, dan mengeraskan jaringan untuk pemrosesan dan pemotongan selanjutnya. Kualitas setiap teknik hilir — pewarnaan H&E, IHC, analisis molekuler — tergantung pada fiksasi yang memadai dan tepat.
Tujuan Fiksasi
Tujuan utama fiksasi adalah untuk mencegah autolisis (pencernaan sendiri oleh enzim intraseluler) dan pembusukan (dekomposisi bakteri); untuk mempertahankan morfologi jaringan sedekat mungkin dengan keadaan hidup; untuk mengeraskan jaringan untuk pemotongan tanpa distorsi; untuk menstabilkan komponen seluler (protein, asam nukleat, karbohidrat) untuk pewarnaan; dan untuk membuat sel permeabel terhadap zat warna dan antibodi. Tidak ada satu fiksatif pun yang mencapai semua tujuan secara optimal — pilihan tergantung pada aplikasi hilir yang dimaksudkan.
Kimia Formalin
10% neutral buffered formalin (NBF) adalah fiksatif universal dalam histopatologi. Formalin komersial adalah larutan berair 37% dari gas formaldehida — 10% NBF adalah pengenceran 1:10 (3,7% formaldehida). Buffer netral (natrium fosfat monobasa dan dibasa, pH 7,0-7,2) mencegah pembentukan asam format (yang menyebabkan pigmen hematin asam) dan mempertahankan kondisi ikatan-silang optimal.
Formaldehida mengikat-silang protein dengan membentuk jembatan metilen (-CH2-) antara gugus amino yang berdekatan, terutama gugus epsilon-amino lisin dan gugus amida peptida. Ini menciptakan jaringan gel tiga dimensi yang menstabilkan struktur jaringan. Ikatan-silang tergantung suhu — berlangsung sekitar dua kali lebih cepat pada 37°C daripada pada suhu kamar. Fiksasi rutin pada suhu kamar memerlukan 6-24 jam untuk biopsi kecil dan 24-48 jam untuk spesimen yang lebih besar. Aturan standar adalah 1 jam per mm ketebalan jaringan.
Faktor yang Mempengaruhi Fiksasi
Volume fiksatif harus setidaknya 10-20 kali volume jaringan. Volume yang tidak memadai menghabiskan fiksatif sebelum penetrasi selesai. Ketebalan jaringan — irisan harus tidak lebih tebal dari 4-5 mm untuk penetrasi yang memadai; irisan lebih tebal difiksasi dengan buruk di pusat. Suhu — suhu lebih tinggi mempercepat fiksasi tetapi meningkatkan autolisis sebelum fiksatif menembus; suhu kamar optimal untuk penggunaan rutin. Agitasi — rotasi lembut meningkatkan sirkulasi fiksatif di sekitar spesimen. Keterlambatan fiksasi — waktu iskemia hangat (waktu dari penjepitan vaskular hingga pengangkatan spesimen) dan waktu iskemia dingin (waktu dari pengangkatan hingga fiksasi) harus diminimalkan. Iskemia dingin yang berkepanjangan mendegradasi RNA, protein, dan fosfoprotein (mempengaruhi IHC, terutama ER dan penanda spesifik-fosfo).
Jenis Fiksatif
Fiksatif pengikat-silang (aldehida) — formaldehida, glutaraldehida (untuk EM), glyoxal (alternatif kurang toksik). Glutaraldehida memberikan preservasi ultrastruktur unggul tetapi menembus lambat dan menyebabkan lebih banyak ikatan-silang, yang dapat menutupi antigen untuk IHC.
Fiksatif koagulatif — etanol, metanol, aseton. Ini mengendapkan protein dengan mengganggu kerang hidrasi daripada mengikat-silang. Mereka mempertahankan aktivitas enzim dan asam nukleat tetapi menyebabkan lebih banyak penyusutan dan mengeraskan jaringan dengan cepat. Fiksasi alkohol digunakan untuk PCR dan pengujian molekuler.
Fiksatif kombinasi — larutan Bouin (asam pikrat, formaldehida, asam asetat) memberikan detail inti yang sangat baik dan digunakan untuk jaringan endokrin, biopsi testis, dan biopsi gastrointestinal. Fiksatif B5 (merkuri klorida, formaldehida) secara historis digunakan untuk kelenjar getah bening tetapi kini jarang digunakan karena toksisitas merkuri. Zinc formalin adalah alternatif bebas merkuri untuk preservasi antigen limfoid.
Alternatif non-pengikat-silang — fiksatif molekuler (PAXgene, HOPE) mempertahankan asam nukleat dan protein untuk analisis molekuler tetapi memberikan morfologi yang kurang optimal dibandingkan formalin. Mereka digunakan terutama dalam biobanking dan pengaturan penelitian.
Pemrosesan Pasca-Fiksasi
Setelah fiksasi, spesimen dipindahkan ke etanol 70% untuk penyimpanan jika pemrosesan ditunda. Jaringan dapat tetap dalam etanol 70% selama berminggu-minggu tanpa efek buruk. Penyimpanan berkepanjangan dalam formalin (>72 jam) menyebabkan fiksasi berlebihan yang meningkatkan penutupan antigen dan fragmentasi DNA. Untuk preservasi jangka panjang, jaringan tetap formalin dapat dipindahkan ke etanol setelah 24-48 jam.
Kontrol Mutu
Fiksasi dipantau melalui kesegaran fiksatif (larutan diganti secara teratur), waktu fiksasi (didokumentasikan pada permintaan), penampilan (jaringan yang difiksasi dengan baik adalah keras dan seragam pucat), dan kualitas pewarnaan hilir (fiksasi buruk bermanifestasi sebagai detail inti buruk, pucat, atau efek tepi pada H&E). Program jaminan mutu mencakup tinjauan rutin indikator kecukupan fiksasi.
