Ikhtisar

Anotasi genom adalah proses melampirkan makna biologis pada urutan mentah genom yang dirangkai. Ini mengidentifikasi lokasi gen, batas ekson-intronnya, urutan regulasi, elemen berulang, dan RNA non-coding. Anotasi menjembatani kesenjangan antara rangkaian DNA statis dan fungsi biologis dinamis yang dikodekannya. Prediksi komputasi dan bukti eksperimental diintegrasikan untuk menghasilkan peta fitur genom yang komprehensif. Ketika pengurutan genom menjadi lebih cepat dan lebih murah, hambatan anotasi – mengubah data sekuens menjadi wawasan biologis – menjadi semakin kritis.

Metode

Strategi anotasi terbagi dalam tiga kategori. Prediksi ab initio menggunakan model statistik struktur gen (seperti model Markov tersembunyi) untuk mengidentifikasi wilayah pengkodean langsung dari komposisi urutan. Anotasi berbasis homologi menyelaraskan tag urutan yang diungkapkan, protein, atau pembacaan sekuen RNA dari spesies yang sama atau terkait untuk menyimpulkan struktur gen. Anotasi komparatif memanfaatkan konservasi evolusioner di berbagai spesies untuk menentukan elemen fungsional. Pipeline seperti NCBI Eukaryotic Genome Annotation Pipeline menggabungkan ketiga pendekatan tersebut, diikuti dengan kurasi manual untuk menyelesaikan kasus-kasus ambigu. Kualitas dinilai melalui metrik seperti Jarak Edit Anotasi (AED).

Aplikasi

Anotasi yang akurat sangat penting untuk menafsirkan proyek pengurutan. Dalam penelitian biomedis, hal ini memungkinkan penemuan mutasi penyebab penyakit dengan mengungkap wilayah genom mana yang mengkode protein atau elemen pengatur. Genomik pertanian menggunakan anotasi untuk menghubungkan gen dengan sifat-sifat seperti hasil dan toleransi terhadap stres. Teknik seperti teknologi DNA rekombinan bergantung pada model gen yang andal untuk kloning dan ekspresi. Anotasi juga mendukung genetika bakteri dengan mengidentifikasi operon dan faktor virulensi, sedangkan studi tentang regulasi gen dan epigenetika mengandalkan koordinat yang tepat dari promotor, peningkat, dan fitur regulasi lainnya.

Protokol Praktis

Alur anotasi MAKER mengintegrasikan prediksi ab initio, protein, dan bukti transkrip ke dalam anotasi terpadu. Siapkan file maker_opts.ctl yang menentukan genom FASTA, perpustakaan berulang (misalnya, dari RepeatModeler), dan penyelarasan EST/protein dari organisme yang berkerabat dekat. Jalankan RepeatMasker untuk melakukan pengulangan soft-mask: RepeatMasker -species mamalia genome.fa. Jalankan MAKER dalam tiga putaran berulang: pertama dengan hanya EST dan bukti protein (maker -g genome.fa), yang menghasilkan model gen awal melalui penggabungan transkrip dan protein. Pada putaran kedua, latih prediktor gen ab initio (AUGUSTUS atau SNAP) pada model MAKER berkeyakinan tinggi dari putaran pertama: snap -train -c score 1 -gff maker.gff genome.fa. Putaran ketiga memutar ulang MAKER dengan mengaktifkan prediktor terlatih, menghasilkan anotasi akhir. BRAKER2 memperluas pendekatan ini untuk spesies dengan data RNA-seq: menyelaraskan pembacaan dengan STAR, jalankan BRAKER2.pl --genome=genome.fa --bam=aligned.bam --species=species, yang secara otomatis melatih GeneMark-ET dan AUGUSTUS. Kualitas anotasi dinilai dengan metrik Jarak Edit Anotasi (AED): AED < 0,25 menunjukkan model dengan tingkat keyakinan tinggi. Kelengkapan BUSCO terhadap garis keturunan yang sesuai diharapkan di atas 90% untuk genom yang beranotasi dengan baik. Bandingkan anotasi Anda dengan anotasi yang sudah ada dengan gffcompare. Untuk anotasi RNA non-coding, jalankan Infernal dengan model kovarians Rfam. Anotasi fungsional dari protein yang diprediksi menggunakan InterProScan: interproscan.sh -i protein.faa -f TSV -dp, yang menetapkan istilah Gene Ontology dan anotasi domain. File GFF3 akhir harus diurutkan, divalidasi dengan genometools gt gff3validator, dan diindeks dengan tabix.