Teknologi DNA rekombinan menggabungkan molekul DNA dari sumber yang berbeda untuk menciptakan kombinasi genetik baru yang tidak terjadi secara alami. Ini adalah fondasi biologi molekuler modern dan telah memungkinkan produksi protein terapeutik, organisme yang dimodifikasi secara genetik, dan pengurutan seluruh genom.

Enzim Restriksi

Endonuklease restriksi adalah enzim bakteri yang membelah DNA pada sekuens pengenalan spesifik, biasanya sepanjang 4 hingga 8 pasangan basa. Enzim restriksi Tipe II mengenali sekuens palindromik dan membelah di dalam situs pengenalan, menghasilkan ujung tumpul atau potongan bergerigi yang menciptakan ujung lengket dengan overhang untai tunggal pendek. EcoRI mengenali GAATTC dan menghasilkan ujung lengket dengan overhang AATT, sementara SmaI mengenali CCCGGG dan menghasilkan ujung tumpul. Spesifisitas enzim restriksi memungkinkan fragmen DNA yang ditentukan untuk dihasilkan dan digabungkan, sementara PCR menyediakan metode alternatif untuk mengamplifikasi sekuens DNA spesifik.

DNA Ligase

DNA ligase menutup celah di tulang punggung DNA dengan mengkatalisis pembentukan ikatan fosfodiester antara hidroksil 3-prime dan fosfat 5-prime. T4 DNA ligase, enzim yang paling umum digunakan untuk kloning, dapat menyambungkan ujung lengket dan ujung tumpul. Ligasi ujung lengket sangat efisien karena overhang komplementer menyelaraskan fragmen dengan benar. Ligasi ujung tumpul kurang efisien tetapi tidak memerlukan overhang yang kompatibel. Enzim menggunakan ATP sebagai sumber energi, membentuk zat antara AMP-enzim yang mengaktifkan fosfat 5-prime.

Vektor Kloning

Plasmid adalah molekul DNA sirkular kecil yang bereplikasi secara independen dari kromosom bakteri. Plasmid adalah vektor yang paling umum untuk kloning DNA, membawa asal replikasi, penanda seleksi seperti gen resistensi antibiotik, dan situs kloning ganda yang mengandung situs restriksi unik. Seri plasmid pUC menggunakan gen lacZ untuk penyaringan biru-putih, di mana inaktivasi insersional lacZ memungkinkan rekombinan dibedakan dari non-rekombinan oleh warna putihnya pada pelat X-gal.

Kromosom artifisial bakteri didasarkan pada faktor F E. coli dan dapat membawa sisipan hingga 300 kilobasa. Kromosom artifisial ragi mengandung sekuens sentromerik, telomerik, dan replikasi untuk propagasi dalam ragi dan dapat membawa sisipan melebihi satu megabasa. Vektor sisipan besar ini penting untuk proyek pemetaan dan pengurutan genom.

Vektor Ekspresi

Vektor ekspresi mengandung sekuens pengatur yang mendorong transkripsi dan translasi gen yang dikloning dalam organisme inang. Vektor ekspresi bakteri menggunakan promotor kuat seperti promotor T7 atau tac, seringkali dengan sistem yang dapat diinduksi untuk ekspresi terkendali. Operator lac memungkinkan induksi dengan IPTG, dan sistem T7 menggunakan RNA polimerase T7 di bawah kendali lac. Tag fusi seperti 6xHis, GST, atau MBP sering ditambahkan untuk memfasilitasi pemurnian dan deteksi.

Vektor ekspresi eukariotik menggunakan promotor dari sitomegalovirus atau virus simian 40 untuk ekspresi kuat dalam sel mamalia. Mereka menyertakan sinyal poliadenilasi untuk pemrosesan mRNA yang tepat dan seringkali penanda seleksi seperti resistensi neomisin untuk generasi garis sel stabil. Vektor virus yang berasal dari AAV, lentivirus, atau retrovirus digunakan ketika pengiriman dan integrasi yang efisien diperlukan.

Organisme Inang

E. coli adalah inang yang paling umum untuk kloning DNA, menawarkan pertumbuhan cepat, efisiensi transformasi tinggi, dan genetika yang dikarakterisasi dengan baik. Strain khusus tersedia untuk tujuan tertentu: DH5-alpha untuk kloning, BL21 untuk ekspresi protein, dan CJ236 untuk menghasilkan templat yang mengandung urasil. Ragi, khususnya Saccharomyces cerevisiae, digunakan untuk mengkloning fragmen DNA besar dan untuk mengekspresikan protein eukariotik yang memerlukan modifikasi pasca-translasi.

Garis sel mamalia seperti sel HEK293 dan CHO digunakan untuk memproduksi protein terapeutik dengan pola glikosilasi yang kompatibel dengan manusia. Sel serangga yang diinfeksi dengan vektor bakulovirus memberikan hasil protein tinggi dengan pemrosesan eukariotik. Sistem bebas sel menggunakan ekstrak dari E. coli, kuman gandum, atau retikulosit kelinci memungkinkan produksi protein cepat tanpa sel hidup.

Aplikasi

Teknologi DNA rekombinan telah menghasilkan banyak protein terapeutik. Insulin manusia adalah terapi rekombinan pertama, diproduksi di E. coli oleh Genentech dan disetujui pada tahun 1982. Protein rekombinan lainnya termasuk hormon pertumbuhan, eritropoietin, faktor VIII untuk hemofilia, dan antibodi monoklonal. Teknologi ini memungkinkan produksi protein manusia dalam jumlah besar tanpa bergantung pada sumber hewani.

Organisme yang dimodifikasi secara genetik dibuat dengan memperkenalkan DNA rekombinan ke dalam tanaman, hewan, atau mikroorganisme. Tanaman Bt mengekspresikan protein insektisida dari Bacillus thuringiensis. Mikroba rekombinan memproduksi enzim industri, biofuel, dan biokimia. Teknologi ini juga digunakan untuk analisis fungsi gen, menciptakan organisme knockout dan transgenik, serta memproduksi vaksin seperti antigen permukaan hepatitis B yang diproduksi dalam ragi.