La technologie de l’ADN recombinant combine des molécules d’ADN de différentes sources pour créer de nouvelles combinaisons génétiques qui n’existent pas naturellement. Elle est le fondement de la biologie moléculaire moderne et a permis la production de protéines thérapeutiques, d’organismes génétiquement modifiés et le séquençage de génomes entiers.

Enzymes de Restriction

Les endonucléases de restriction sont des enzymes bactériennes qui clivent l’ADN à des séquences de reconnaissance spécifiques, typiquement de 4 à 8 paires de bases. Les enzymes de restriction de type II reconnaissent des séquences palindromiques et coupent dans le site de reconnaissance, produisant soit des extrémités franches, soit des coupures décalées qui créent des extrémités cohésives avec de courtes surplombs simple brin. EcoRI reconnaît GAATTC et produit des extrémités cohésives avec un surplomb AATT, tandis que SmaI reconnaît CCCGGG et produit des extrémités franches. La spécificité des enzymes de restriction permet de générer et de combiner des fragments d’ADN définis, tandis que la PCR fournit une méthode alternative pour amplifier des séquences d’ADN spécifiques.

ADN Ligase

L’ADN ligase scelle les entailles dans le squelette de l’ADN en catalysant la formation d’une liaison phosphodiester entre un hydroxyle 3’ et un phosphate 5’. La T4 ADN ligase, l’enzyme la plus couramment utilisée pour le clonage, peut ligaturer les extrémités cohésives et franches. La ligature d’extrémités cohésives est très efficace car les surplombs complémentaires alignent correctement les fragments. La ligature d’extrémités franches est moins efficace mais ne nécessite pas de surplombs compatibles. L’enzyme utilise l’ATP comme source d’énergie, formant un intermédiaire AMP-enzyme qui active le phosphate 5’.

Vecteurs de Clonage

Les plasmides sont de petites molécules d’ADN circulaires qui se répliquent indépendamment du chromosome bactérien. Ce sont les vecteurs les plus courants pour le clonage d’ADN, portant une origine de réplication, un marqueur de sélection tel qu’un gène de résistance aux antibiotiques, et un site de clonage multiple contenant des sites de restriction uniques. La série de plasmides pUC utilise le gène lacZ pour le criblage bleu-blanc, où l’inactivation insertionnelle de lacZ permet de distinguer les recombinants des non-recombinants par leur couleur blanche sur des plaques X-gal.

Les chromosomes artificiels bactériens sont basés sur le facteur F d’E. coli et peuvent porter des inserts allant jusqu’à 300 kilobases. Les chromosomes artificiels de levure contiennent des séquences centromériques, télomériques et de réplication pour la propagation dans la levure et peuvent porter des inserts dépassant un mégabase. Ces vecteurs à grands inserts sont essentiels pour les projets de cartographie et de séquençage du génome.

Vecteurs d’Expression

Les vecteurs d’expression contiennent des séquences régulatrices qui dirigent la transcription et la traduction du gène cloné dans un organisme hôte. Les vecteurs d’expression bactériens utilisent des promoteurs forts tels que le promoteur T7 ou tac, souvent avec un système inductible pour l’expression contrôlée. L’opérateur lac permet l’induction par l’IPTG, et le système T7 utilise l’ARN polymérase T7 sous contrôle lac. Des tags de fusion tels que 6xHis, GST ou MBP sont souvent ajoutés pour faciliter la purification et la détection.

Les vecteurs d’expression eucaryotes utilisent des promoteurs du cytomégalovirus ou du virus simien 40 pour une expression forte dans les cellules de mammifères. Ils incluent un signal de polyadénylation pour un traitement approprié de l’ARNm et souvent un marqueur de sélection tel que la résistance à la néomycine pour la génération de lignées cellulaires stables. Les vecteurs viraux dérivés de l’AAV, du lentivirus ou du rétrovirus sont utilisés lorsque une délivrance et une intégration efficaces sont nécessaires.

Organismes Hôtes

E. coli est l’hôte le plus courant pour le clonage d’ADN, offrant une croissance rapide, une haute efficacité de transformation et une génétique bien caractérisée. Des souches spécialisées sont disponibles pour des usages spécifiques : DH5-alpha pour le clonage, BL21 pour l’expression de protéines, et CJ236 pour la génération de matrices contenant l’uracile. La levure, particulièrement Saccharomyces cerevisiae, est utilisée pour le clonage de grands fragments d’ADN et pour l’expression de protéines eucaryotes nécessitant des modifications post-traductionnelles.

Les lignées cellulaires de mammifères telles que HEK293 et CHO sont utilisées pour produire des protéines thérapeutiques avec des profils de glycosylation compatibles avec l’humain. Les cellules d’insectes infectées par des vecteurs baculovirus fournissent des rendements protéiques élevés avec un traitement eucaryote. Les systèmes acellulaires utilisant des extraits d’E. coli, de germe de blé ou de réticulocytes de lapin permettent une production rapide de protéines sans cellules vivantes.

Applications

La technologie de l’ADN recombinant a produit de nombreuses protéines thérapeutiques. L’insuline humaine a été le premier produit recombinant thérapeutique, produite dans E. coli par Genentech et approuvée en 1982. D’autres protéines recombinantes comprennent l’hormone de croissance, l’érythropoïétine, le facteur VIII pour l’hémophilie et les anticorps monoclonaux. La technologie permet la production de protéines humaines en grandes quantités sans recourir à des sources animales.

Les organismes génétiquement modifiés sont créés en introduisant de l’ADN recombinant dans des plantes, des animaux ou des micro-organismes. Les cultures Bt expriment des protéines insecticides de Bacillus thuringiensis. Les microbes recombinants produisent des enzymes industrielles, des biocarburants et des produits biochimiques. La technologie est également utilisée pour l’analyse de la fonction des gènes, la création d’organismes knockout et transgéniques, et la production de vaccins tels que l’antigène de surface de l’hépatite B produit dans la levure.