Die rekombinante DNA-Technologie kombiniert DNA-Moleküle aus verschiedenen Quellen, um neue genetische Kombinationen zu schaffen, die in der Natur nicht vorkommen. Sie ist die Grundlage der modernen Molekularbiologie und hat die Produktion therapeutischer Proteine, genetisch veränderter Organismen und die Sequenzierung ganzer Genome ermöglicht.

Restriktionsenzyme

Restriktionsendonukleasen sind bakterielle Enzyme, die DNA an spezifischen Erkennungssequenzen schneiden, typischerweise 4 bis 8 Basenpaare lang. Typ-II-Restriktionsenzyme erkennen palindromische Sequenzen und schneiden innerhalb der Erkennungsstelle, wobei sie entweder stumpfe Enden oder versetzte Schnitte erzeugen, die klebrige Enden mit kurzen einzelsträngigen Überhängen bilden. EcoRI erkennt GAATTC und erzeugt klebrige Enden mit einem AATT-Überhang, während SmaI CCCGGG erkennt und stumpfe Enden erzeugt. Die Spezifität der Restriktionsenzyme ermöglicht es, definierte DNA-Fragmente zu erzeugen und zu kombinieren, während die PCR eine alternative Methode zur Amplifikation spezifischer DNA-Sequenzen darstellt.

DNA-Ligase

Die DNA-Ligase schließt Brüche im DNA-Rückgrat, indem sie die Bildung einer Phosphodiesterbindung zwischen einer 3’-Hydroxylgruppe und einem 5’-Phosphat katalysiert. Die T4-DNA-Ligase, das am häufigsten für Klonierungen verwendete Enzym, kann sowohl klebrige als auch stumpfe Enden ligieren. Die Ligation klebriger Enden ist hoch effizient, da die komplementären Überhänge die Fragmente korrekt ausrichten. Die Ligation stumpfer Enden ist weniger effizient, erfordert jedoch keine kompatiblen Überhänge. Das Enzym verwendet ATP als Energiequelle und bildet ein AMP-Enzym-Zwischenprodukt, das das 5’-Phosphat aktiviert.

Klonierungsvektoren

Plasmide sind kleine, zirkuläre DNA-Moleküle, die unabhängig vom bakteriellen Chromosom replizieren. Sie sind die häufigsten Vektoren für die DNA-Klonierung und tragen einen Replikationsursprung, einen selektierbaren Marker wie ein Antibiotikaresistenzgen und eine multiple Klonierungsstelle mit einzigartigen Restriktionsschnittstellen. Die pUC-Serie von Plasmiden verwendet das lacZ-Gen für die Blau-Weiß-Selektion, bei der die insertionale Inaktivierung von lacZ es ermöglicht, Rekombinanten von Nicht-Rekombinanten durch ihre weiße Farbe auf X-Gal-Platten zu unterscheiden.

Bakterielle artifizielle Chromosomen basieren auf dem E. coli-F-Faktor und können Inserts von bis zu 300 Kilobasen aufnehmen. Hefe-artifizielle Chromosomen enthalten Zentromer-, Telomer- und Replikationssequenzen zur Vermehrung in Hefe und können Inserts von über einer Megabase aufnehmen. Diese Vektoren mit großen Inserts sind für Genomkartierungs- und Sequenzierungsprojekte unerlässlich.

Expressionsvektoren

Expressionsvektoren enthalten regulatorische Sequenzen, die die Transkription und Translation des klonierten Gens in einem Wirtsorganismus steuern. Bakterielle Expressionsvektoren verwenden starke Promotoren wie den T7- oder tac-Promotor, oft mit einem induzierbaren System zur kontrollierten Expression. Der lac-Operator ermöglicht die Induktion mit IPTG und das T7-System verwendet die T7-RNA-Polymerase unter lac-Kontrolle. Fusionsmarker wie 6xHis, GST oder MBP werden häufig hinzugefügt, um die Reinigung und Detektion zu erleichtern.

Eukaryotische Expressionsvektoren verwenden Promotoren des Cytomegalovirus oder des Simian-Virus 40 für eine starke Expression in Säugetierzellen. Sie enthalten ein Polyadenylierungssignal für die korrekte mRNA-Prozessierung und oft einen selektierbaren Marker wie Neomycin-Resistenz zur Erzeugung stabiler Zelllinien. Virale Vektoren, die von AAV, Lentivirus oder Retrovirus abgeleitet sind, werden verwendet, wenn ein effizienter Transfer und eine Integration erforderlich sind.

Wirtsorganismen

E. coli ist der häufigste Wirt für die DNA-Klonierung und bietet schnelles Wachstum, hohe Transformationseffizienz und gut charakterisierte Genetik. Spezialisierte Stämme sind für bestimmte Zwecke verfügbar: DH5-alpha für die Klonierung, BL21 für die Proteinexpression und CJ236 für die Erzeugung Uracil-haltiger Matrizen. Hefe, insbesondere Saccharomyces cerevisiae, wird für die Klonierung großer DNA-Fragmente und für die Expression eukaryotischer Proteine verwendet, die posttranslationale Modifikationen erfordern.

Säugetier-Zelllinien wie HEK293- und CHO-Zellen werden für die Produktion therapeutischer Proteine mit humanen Glykosylierungsmustern verwendet. Insektenzellen, die mit Baculovirus-Vektoren infiziert sind, liefern hohe Proteinausbeuten mit eukaryotischer Prozessierung. Zellfreie Systeme mit Extrakten aus E. coli, Weizenkeimen oder Kaninchenretikulozyten ermöglichen eine schnelle Proteinproduktion ohne lebende Zellen.

Anwendungen

Die rekombinante DNA-Technologie hat viele therapeutische Proteine hervorgebracht. Humaninsulin war das erste rekombinante Therapeutikum, wurde in E. coli von Genentech hergestellt und 1982 zugelassen. Weitere rekombinante Proteine sind Wachstumshormon, Erythropoietin, Faktor VIII für Hämophilie und monoklonale Antikörper. Die Technologie ermöglicht die Produktion menschlicher Proteine in großen Mengen ohne Rückgriff auf tierische Quellen.

Genetisch veränderte Organismen werden durch die Einführung rekombinanter DNA in Pflanzen, Tiere oder Mikroorganismen erzeugt. Bt-Pflanzen exprimieren insektizide Proteine aus Bacillus thuringiensis. Rekombinante Mikroben produzieren industrielle Enzyme, Biokraftstoffe und Biochemikalien. Die Technologie wird auch für die Genfunktionsanalyse, die Erzeugung von Knockout- und transgenen Organismen und die Produktion von Impfstoffen wie dem in Hefe produzierten Hepatitis-B-Oberflächenantigen eingesetzt.