A tecnologia do DNA recombinante combina moléculas de DNA de diferentes fontes para criar novas combinações genéticas que não ocorrem naturalmente. É a fundação da biologia molecular moderna e permitiu a produção de proteínas terapêuticas, organismos geneticamente modificados e o sequenciamento de genomas inteiros.

Enzimas de Restrição

As endonucleases de restrição são enzimas bacterianas que clivam o DNA em sequências de reconhecimento específicas, tipicamente de 4 a 8 pares de base de comprimento. As enzimas de restrição Tipo II reconhecem sequências palindrômicas e cortam dentro do sítio de reconhecimento, produzindo extremidades cegas ou cortes escalonados que criam extremidades coesivas com saliências curtas de fita simples. EcoRI reconhece GAATTC e produz extremidades coesivas com uma saliência AATT, enquanto SmaI reconhece CCCGGG e produz extremidades cegas. A especificidade das enzimas de restrição permite que fragmentos definidos de DNA sejam gerados e combinados, enquanto a PCR fornece um método alternativo para amplificar sequências específicas de DNA.

DNA Ligase

A DNA ligase sela entalhes no esqueleto do DNA catalisando a formação de uma ligação fosfodiéster entre uma hidroxila 3-prima e um fosfato 5-prima. A T4 DNA ligase, a enzima mais comumente usada para clonagem, pode ligar tanto extremidades coesivas quanto cegas. A ligação de extremidades coesivas é altamente eficiente porque as saliências complementares alinham os fragmentos corretamente. A ligação de extremidades cegas é menos eficiente, mas não requer saliências compatíveis. A enzima usa ATP como fonte de energia, formando um intermediário AMP-enzima que ativa o fosfato 5-prima.

Vetores de Clonagem

Os plasmídeos são moléculas pequenas e circulares de DNA que se replicam independentemente do cromossomo bacteriano. São os vetores mais comuns para clonagem de DNA, carregando uma origem de replicação, um marcador selecionável como um gene de resistência a antibióticos e um sítio de clonagem múltipla contendo sítios de restrição únicos. A série pUC de plasmídeos usa o gene lacZ para triagem azul-branco, onde a inativação insercional de lacZ permite que recombinantes sejam distinguidos de não recombinantes por sua cor branca em placas de X-gal.

Os cromossomos artificiais bacterianos são baseados no fator F de E. coli e podem carregar insertos de até 300 quilobases. Os cromossomos artificiais de levedura contêm sequências centroméricas, teloméricas e de replicação para propagação em levedura e podem carregar insertos que excedem um megabase. Esses vetores de inserto grande são essenciais para projetos de mapeamento e sequenciamento genômico.

Vetores de Expressão

Os vetores de expressão contêm sequências regulatórias que dirigem a transcrição e tradução do gene clonado em um organismo hospedeiro. Vetores de expressão bacterianos usam promotores fortes como o promotor T7 ou tac, frequentemente com um sistema indutível para expressão controlada. O operador lac permite indução com IPTG, e o sistema T7 usa T7 RNA polimerase sob controle lac. Etiquetas de fusão como 6xHis, GST ou MBP são frequentemente adicionadas para facilitar a purificação e detecção.

Vetores de expressão eucarióticos usam promotores de citomegalovírus ou vírus símio 40 para expressão forte em células de mamíferos. Incluem um sinal de poliadenilação para processamento adequado do mRNA e frequentemente um marcador selecionável como resistência a neomicina para geração de linhagens celulares estáveis. Vetores virais derivados de AAV, lentivírus ou retrovírus são usados quando são necessários entrega e integração eficientes.

Organismos Hospedeiros

E. coli é o hospedeiro mais comum para clonagem de DNA, oferecendo crescimento rápido, alta eficiência de transformação e genética bem caracterizada. Linhagens especializadas estão disponíveis para propósitos específicos: DH5-alpha para clonagem, BL21 para expressão de proteínas e CJ236 para geração de moldes contendo uracila. Levedura, particularmente Saccharomyces cerevisiae, é usada para clonar grandes fragmentos de DNA e para expressar proteínas eucarióticas que requerem modificações pós-traducionais.

Linhagens de células de mamíferos como HEK293 e células CHO são usadas para produzir proteínas terapêuticas com padrões de glicosilação compatíveis com humanos. Células de inseto infectadas com vetores baculovírus fornecem alto rendimento de proteínas com processamento eucariótico. Sistemas livres de células usando extratos de E. coli, germe de trigo ou reticulócitos de coelho permitem produção rápida de proteínas sem células vivas.

Aplicações

A tecnologia do DNA recombinante produziu muitas proteínas terapêuticas. A insulina humana foi o primeiro recombinante terapêutico, produzida em E. coli pela Genentech e aprovada em 1982. Outras proteínas recombinantes incluem hormônio do crescimento, eritropoietina, fator VIII para hemofilia e anticorpos monoclonais. A tecnologia permite a produção de proteínas humanas em grandes quantidades sem depender de fontes animais.

Organismos geneticamente modificados são criados introduzindo DNA recombinante em plantas, animais ou microrganismos. Culturas Bt expressam proteínas inseticidas de Bacillus thuringiensis. Micróbios recombinantes produzem enzimas industriais, biocombustíveis e produtos bioquímicos. A tecnologia também é usada para análise de função gênica, criação de organismos knockout e transgênicos, e produção de vacinas como o antígeno de superfície da hepatite B produzido em levedura.