A purificação de plasmídeos, também conhecida como miniprep, é uma técnica usada para isolar pequenas moléculas circulares de DNA (plasmídeos) de células bacterianas. Plasmídeos são comumente usados como vetores em clonagem molecular, e purificá-los é essencial para sequenciamento, transfecção e manipulação adicional.
Como funciona a purificação de plasmídeos
- Cultura Bacteriana
Uma única colónia bacteriana contendo o plasmídeo desejado é cultivada durante a noite em meio líquido com o antibiótico apropriado. Isso garante que as bactérias mantenham o plasmídeo e produzam o suficiente para extração.
- Colheita Celular e Lise
A cultura bacteriana é centrifugada para sedimentar as células. O sedimento é ressuspenso num tampão contendo RNase (para digerir o RNA) e depois tratado com uma solução de lise alcalina contendo SDS e hidróxido de sódio. Isso quebra as células e desnatura o DNA.
- Neutralização
É adicionado um tampão de neutralização contendo acetato de potássio. A alta concentração de sal faz com que o DNA cromossômico desnaturado e as proteínas precipitem, enquanto o DNA plasmídico menor e superenrolado permanece em solução. A mistura é centrifugada e o sobrenadante contendo plasmídeo é recolhido.
- Encadernação e lavagem
O sobrenadante é passado através de uma coluna de membrana de sílica sob condições que fazem com que o DNA plasmídico se ligue. Um tampão de lavagem remove contaminantes restantes, como sais, proteínas e RNA.
- Eluição
O DNA plasmídico purificado é liberado da membrana usando um tampão com baixo teor de sal ou água. O DNA resultante é suficientemente puro para sequenciamento, digestão de restrição ou transfecção de células eucarióticas.
Protocolo Prático de Miniprep (Lise Alcalina)
Inocular uma única colônia bacteriana em 3–5 mL de meio LB com o antibiótico apropriado e incubar a 37°C com agitação a 220 rpm por 12–16 horas. Colha as células centrifugando 1,5–2 mL de cultura a 8.000 × g por 2 minutos. Descartar o sobrenadante e ressuspender a pelota em 250 μL de tampão de ressuspensão (P1, contendo 50 mM Tris-HCl pH 8,0, 10 mM EDTA e 100 μg/mL RNase A). Adicione 250 μL de tampão de lise (P2, 200 mM NaOH, 1% SDS), misture suavemente invertendo 4–6 vezes e incube em temperatura ambiente por 3 minutos, não vórtice ou exceda 5 minutos. Adicione 350 μL de tampão de neutralização (P3, acetato de potássio 3 M pH 5,5), misture imediatamente invertendo e incubar em gelo por 5 minutos. Centrifugar a 13.000 × g por 10 minutos. Transfira o sobrenadante claro para uma coluna de membrana de sílica. Centrifugar a 13.000 × g por 1 minuto e descartar o fluxo. Lave com 750 μL de tampão de lavagem (contendo etanol) e centrifugue por 1 minuto. Repita com uma segunda lavagem. Seque a coluna centrifugando durante 2 minutos. Eluir o DNA em 30-50 μL de tampão de eluição (10 mM Tris-HCl pH 8,5) ou água livre de nuclease por centrifugação por 1 minuto após uma incubação de 2 minutos. Avalie o rendimento por espectrofotometria UV, uma cultura típica de 5 mL produz 5–15 µg de DNA plasmídico com A260/A280 > 1,8 e A260/A230 > 2,0. Para plasmídeos de baixa cópia, aumente o volume de cultura para 10 mL ou use um kit de purificação específico para baixa cópia.
Aplicação no mundo real
Após clonagem de uma inserção de 1,5 kb em pET-28a, são cultivadas 6 colónias positivas para miniprep. As leituras do A260 mostram rendimentos de 8–12 µg por preparação. A digestão de restrição com NcoI e XhoI confirma a inserção em todas as 6 amostras. Os plasmídeos purificados são enviados para sequenciamento Sanger, retornando cromatogramas de alta qualidade e sem ruído de fundo.
