Digesti enzim restriksi adalah teknik yang digunakan untuk memotong DNA pada situs-situs spesifik yang telah ditentukan. Enzim restriksi — juga disebut endonuklease restriksi — adalah gunting molekuler yang mengenali sekuens DNA palindromik pendek dan membelah DNA di atau dekat situs-situs ini.
Cara Kerja Digesti Enzim Restriksi
- Memilih Enzim
Setiap enzim restriksi mengenali sekuens DNA spesifik, biasanya panjangnya 4–8 pasang basa. Contoh umum termasuk EcoRI (GAATTC) dan HindIII (AAGCTT). Ilmuwan memilih enzim berdasarkan di mana mereka memotong relatif terhadap wilayah DNA yang diminati.
- Menyiapkan Reaksi
DNA yang telah dimurnikan dicampur dengan enzim restriksi, buffer spesifik untuk enzim tersebut, dan air. Buffer menyediakan konsentrasi garam dan pH optimal agar enzim berfungsi. Campuran diinkubasi pada suhu optimal enzim, biasanya 37°C.
- Inkubasi
Selama inkubasi, enzim memindai DNA untuk sekuens pengenalannya. Setelah menemukan kecocokan, ia memotong tulang punggung DNA di lokasi yang tepat. Jika DNA mengandung beberapa situs pengenalan, ia akan dipotong menjadi beberapa fragmen dengan ukuran yang bervariasi.
- Inaktivasi Panas
Setelah waktu inkubasi yang cukup, reaksi sering dipanaskan hingga 65–80°C untuk mendenaturasi dan menonaktifkan enzim, menghentikan digesti. Fragmen DNA yang dihasilkan kemudian dapat dianalisis dengan elektroforesis gel agarosa atau digunakan dalam aplikasi hilir seperti kloning.
