Pemurnian plasmid, juga dikenal sebagai miniprep, adalah teknik yang digunakan untuk mengisolasi molekul DNA sirkular kecil (plasmid) dari sel bakteri. Plasmid umum digunakan sebagai vektor dalam kloning molekuler, dan memurnikannya sangat penting untuk sekuensing, transfeksi, dan manipulasi lebih lanjut.
Cara Kerja Pemurnian Plasmid
- Kultur Bakteri
Satu koloni bakteri tunggal yang mengandung plasmid yang diinginkan ditumbuhkan semalaman dalam media cair dengan antibiotik yang sesuai. Ini memastikan bakteri mempertahankan plasmid dan memproduksi cukup untuk ekstraksi.
- Pemanenan Sel dan Lisis
Kultur bakteri disentrifugasi untuk melelehkan sel. Pelet diresuspensi dalam buffer yang mengandung RNase (untuk mencerna RNA) dan kemudian diperlakukan dengan larutan lisis alkali yang mengandung SDS dan natrium hidroksida. Ini memecah sel dan mendenaturasi DNA.
- Netralisasi
Buffer netralisasi yang mengandung kalium asetat ditambahkan. Konsentrasi garam yang tinggi menyebabkan DNA kromosom yang terdenaturasi dan protein mengendap, sementara DNA plasmid superkoil yang lebih kecil tetap dalam larutan. Campuran disentrifugasi, dan supernatan yang mengandung plasmid dikumpulkan.
- Pengikatan dan Pencucian
Supernatan dilewatkan melalui membran kolom silika dalam kondisi yang menyebabkan DNA plasmid mengikat. Buffer pencuci menghilangkan kontaminan yang tersisa seperti garam, protein, dan RNA.
- Elusi
DNA plasmid yang telah dimurnikan dilepaskan dari membran menggunakan buffer garam rendah atau air. DNA yang dihasilkan cukup murni untuk sekuensing, digesti restriksi, atau transfeksi sel eukariotik.
