Ligasi DNA dan kloning adalah serangkaian teknik yang digunakan untuk menggabungkan fragmen DNA dan memasukkannya ke dalam vektor — molekul DNA pembawa — untuk replikasi di dalam organisme inang, biasanya bakteri. Ini memungkinkan ilmuwan memproduksi sejumlah besar sekuens DNA tertentu.
Cara Kerja Ligasi DNA dan Kloning
- Menyiapkan Insersi dan Vektor
Baik fragmen DNA yang diminati (insersi) maupun vektor (biasanya plasmid) dipotong dengan enzim restriksi yang sama. Ini menciptakan ujung lengket yang komplementer — overhang untai tunggal pendek yang dapat berpasangan basa satu sama lain.
- Ligasi
Insersi dan vektor yang telah dipotong dicampur bersama dengan DNA ligase, enzim yang menyegel tulang punggung gula-fosfat DNA. Ujung lengket yang komplementer menyelaraskan, dan ligase membentuk ikatan kovalen, menggabungkan insersi secara permanen ke dalam vektor.
- Transformasi
Plasmid yang telah diligasi dimasukkan ke dalam sel bakteri kompeten melalui proses yang disebut transformasi. Ini sering dicapai dengan kejutan panas atau elektroporasi, yang membuat membran bakteri sementara permeabel terhadap DNA.
- Seleksi
Bakteri yang ditransformasi diplot pada agar yang mengandung antibiotik. Plasmid membawa gen resistensi antibiotik, sehingga hanya bakteri yang mengambil plasmid yang bertahan. Ini menciptakan koloni, masing-masing berasal dari satu sel yang mengandung DNA yang dikloning.
- Skrining
Koloni diskrining dengan PCR koloni atau digesti restriksi untuk mengonfirmasi bahwa mereka mengandung insersi yang benar. Koloni positif ditumbuhkan dalam kultur cair untuk memproduksi sejumlah besar plasmid yang diinginkan.
