PCR koloni adalah teknik skrining cepat yang digunakan untuk menentukan apakah koloni bakteri mengandung plasmid dengan insersi DNA yang benar. Alih-alih memurnikan DNA plasmid dari setiap koloni terlebih dahulu, PCR dilakukan langsung pada sejumlah kecil sel bakteri.
Cara Kerja PCR Koloni
- Seleksi Koloni
Koloni bakteri individu yang tumbuh di piring agar diambil menggunakan ujung pipet steril atau tusuk gigi. Setiap koloni disentuh sebentar, mentransfer sejumlah kecil sel. Ujung yang sama digunakan untuk menginokulasi tabung PCR dan piring master untuk kultur selanjutnya.
- Lisis Sel
Sel bakteri dipanaskan hingga 95°C selama beberapa menit selama langkah denaturasi awal PCR. Perlakuan panas ini melisiskan sel, melepaskan DNA plasmid ke dalam campuran reaksi. DNA yang dibebaskan kemudian berfungsi sebagai templat untuk amplifikasi.
- Amplifikasi PCR
Primer yang mengapit wilayah insersi dalam plasmid digunakan. Jika koloni mengandung plasmid dengan insersi yang benar, PCR akan menghasilkan pita pada ukuran yang diharapkan. Jika plasmid kosong (tanpa insersi), pita akan lebih kecil. Jika koloni tidak mengandung plasmid sama sekali, tidak akan ada pita yang dihasilkan.
- Analisis Gel
Produk PCR dianalisis dengan elektroforesis gel agarosa. Koloni yang menghasilkan pita pada ukuran insersi yang diharapkan diidentifikasi sebagai positif. Koloni ini kemudian dapat ditumbuhkan untuk pemurnian plasmid dan analisis lebih lanjut.
- Keuntungan
PCR koloni cepat dan murah, memungkinkan lusinan koloni diskrining dalam beberapa jam. Ini menghilangkan kebutuhan pemurnian plasmid sebelum skrining dan merupakan langkah standar pertama dalam alur kerja kloning molekuler.
