Ikhtisar
Metagenomics adalah studi tentang materi genetik yang diperoleh langsung dari sampel lingkungan atau klinis, tanpa memerlukan budidaya di laboratorium. Pendekatan ini menangkap seluruh keragaman genetik komunitas mikroba, termasuk bakteri, archaea, virus, dan jamur – yang sebagian besar tidak dapat ditumbuhkan dalam kultur murni. Dengan mengurutkan total DNA yang diekstraksi dari tanah, air laut, usus manusia, atau habitat lainnya, metagenomik memberikan jendela yang tidak tergantung pada budaya mengenai komposisi mikroba, potensi metabolisme, dan dinamika komunitas. Bidang ini telah merevolusi mikrobiologi dengan mengungkap sejauh mana sebenarnya keanekaragaman mikroba di Bumi.
Metode
Alur kerja metagenomik dibagi menjadi dua strategi utama. Pengurutan amplikon (misalnya, pengurutan gen 16S rRNA) menargetkan gen penanda yang dilestarikan untuk membuat profil komposisi taksonomi. Metagenomics shotgun mengurutkan semua DNA dalam sampel, memungkinkan analisis gen fungsional dan studi penyelesaian genom. Saluran pipa bioinformatika melakukan pemangkasan kualitas, penghapusan DNA inang, dan klasifikasi taksonomi menggunakan database seperti Kraken2, MetaPhlAn, atau Kaiju. Untuk pembuatan profil fungsional, pembacaan dipetakan ke katalog gen menggunakan alat seperti HUMAnN3. Pendekatan yang lebih maju merakit pembacaan metagenomik menjadi genom rakitan metagenom (MAGs) menggunakan perakit khusus seperti MEGAHIT atau metaSPAdes. BinContigs kemudian digabungkan berdasarkan komposisi dan kelimpahan nukleotida untuk memulihkan genom yang hampir lengkap.
Aplikasi
Metagenomics telah berdampak besar pada kedokteran, ekologi, dan bioteknologi. Proyek mikrobioma manusia mengungkapkan hubungan kuat antara komposisi mikroba usus dan penyakit seperti obesitas, penyakit radang usus, dan diabetes. Metagenomik lingkungan mengungkap enzim baru untuk bioteknologi industri dan memantau komunitas mikroba di mikrobiologi air dan makanan. Dalam kondisi klinis, metagenomik memungkinkan deteksi patogen yang tidak memihak dan pengawasan gen resistensi antimikroba dalam genetika bakteri. Bidang ini terus berkembang dengan kemajuan dalam pengurutan generasi berikutnya yang membuat pengurutan metagenomik mendalam semakin terjangkau.
Protokol Praktis
Untuk analisis metagenomik senapan, mulailah dengan pemangkasan kualitas dari bacaan berpasangan: fastp -i R1.fastq -I R2.fastq -o trimmed_R1.fastq -O trimmed_R2.fastq -q 20 -l 50 --detect_adapter_for_pe. Hapus pembacaan host dengan menyelaraskannya dengan genom host (misalnya, manusia dengan GRCh38) menggunakan Bowtie2: bowtie2 -x host_index -1 trimmed_R1.fastq -2 trimmed_R2.fastq --un-conc-gz host_removed -p 8. Klasifikasi taksonomi dengan Kraken2 membangun database termasuk bakteri, archaea, virus, dan manusia: kraken2-build --standard --db $DBDIR. Klasifikasikan bacaan: kraken2 --db $DBDIR --report report.txt --threads 8 --paired host_removed_1.fastq host_removed_2.fastq > diklasifikasikan.txt. Sempurnakan estimasi kelimpahan dengan Bracken: bracken -d $DBDIR -i report.txt -o bracken_report.txt -r 150 -l S. Untuk kelimpahan pada tingkat spesies, gunakan -l S; untuk tingkat genus gunakan -l G. Pembuatan profil fungsional dengan peta HUMAnN3 dibacakan ke keluarga gen UniRef dan jalur MetaCyc: humann --input trimmed.fastq --output humann_output --threads 8. Outputnya mencakup genefamilies.tsv dan pathabundance.tsv. Untuk metagenomik berbasis perakitan, rakit bersama semua sampel dengan MEGAHIT: megahit -1 R1_list.txt -2 R2_list.txt -o assembly. Bin digabungkan dengan MetaBAT2 menggunakan profil cakupan di seluruh sampel: runMetaBat.sh assembly.final.fa sample1.bam sample2.bam. Nilai kualitas bin dengan CheckM: checkm lineage_wf -x fa bins_dir checkm_output. Hanya tempat sampah dengan kelengkapan >70% dan kontaminasi <10% yang diklasifikasikan sebagai genom rakitan metagenom (MAGs) berkualitas tinggi. Penugasan taksonomi MAG menggunakan GTDB-Tk terhadap Database Taksonomi Genom.
