Ikhtisar
Bioinformatika proteomik adalah disiplin komputasi yang mengubah data spektrometri massa mentah menjadi pengetahuan biologis tentang protein. Hal ini mengatasi kompleksitas proteom yang sangat besar – ribuan protein, masing-masing berpotensi membawa beberapa modifikasi pasca-translasi, varian sambatan, dan produk degradasi. Bidang ini mengembangkan algoritma untuk identifikasi peptida, inferensi protein, kuantifikasi, dan validasi statistik. Dengan mengubah sinyal spektral menjadi protein yang teridentifikasi dan terukur, bioinformatika proteomik memungkinkan peneliti untuk mengajukan pertanyaan tingkat sistem tentang fungsi seluler, mekanisme penyakit, dan respons terhadap obat.
Konsep Utama
Inti dari bidang ini adalah paradigma penelusuran database, yang mana spektrum massa tandem eksperimental dibandingkan dengan spektrum teoritis yang diperoleh dari database urutan protein. Algoritma seperti SEQUEST, Mascot, dan MS-GF+ menetapkan pencocokan spektrum peptida (PSM) menggunakan fungsi penilaian yang memperhitungkan rangkaian ion fragmen dan massa prekursor. Estimasi Tingkat penemuan palsu (FDR) melalui pencarian umpan target mengontrol tingkat kesalahan identifikasi. Inferensi protein mengatasi masalah peptida bersama, peptida yang umum terjadi pada banyak protein, menggunakan prinsip hemat dan pendekatan Bayesian.
Protokol Praktis
Alur kerja pencarian database praktis dimulai dengan memuat file spektrometri massa mentah (.raw, .wiff, atau .d) ke MaxQuant atau Proteome Discoverer. Peneliti menentukan database urutan protein, biasanya proteom manusia atau tikus UniProt yang ditambahkan dengan kontaminan umum seperti keratin dan trypsin. Tripsin diatur sebagai enzim pencernaan yang memungkinkan hingga dua pembelahan yang terlewat. Toleransi massa prekursor diatur ke 10 ppm untuk data Orbitrap dan toleransi massa fragmen diatur ke 0,5 Da untuk perangkap ion atau 20 ppm untuk Orbitrap. Karbamidometilasi sistein ditetapkan sebagai modifikasi tetap; oksidasi asetilasi metionin dan terminal-N sebagai modifikasi variabel. Tingkat penemuan palsu dikontrol menggunakan database umpan target: database umpan dengan urutan terbalik digabungkan ke database target, dan kecocokan spektrum peptida disaring hingga 1% FDR pada tingkat peptida. Inferensi protein menggunakan prinsip kekikiran - kumpulan protein minimal yang menjelaskan semua peptida yang teridentifikasi dilaporkan. Intensitas kuantifikasi bebas label (LFQ) dihitung dari jumlah arus ion yang diekstraksi dari peptida yang ditetapkan. Tabel kelompok protein yang dihasilkan diekspor untuk pengujian statistik pada Perseus atau R. Misalnya, dalam penelitian yang membandingkan jaringan hati yang sehat dan fibrotik, saluran ini mengidentifikasi 4.500 protein dengan kelengkapan 98% dalam enam ulangan biologis. Lebih dari 300 protein memiliki kelimpahan yang berbeda-beda, termasuk protein matriks ekstraseluler yang divalidasi sebagai biomarker fibrosis menggunakan pengujian berbasis antibodi independen. Alur kerja yang sama secara rutin diterapkan dalam proteomik klinis untuk klasifikasi subtipe tumor dari sampel jaringan FFPE.
Aplikasi
Bioinformatika proteomik diterapkan pada seluruh penemuan biomarker, di mana perbedaan ekspresi protein antara jaringan sehat dan jaringan sakit ditambang untuk kandidat diagnostik. Ini mendukung identifikasi target obat dengan membuat profil perubahan kelimpahan protein pada pengobatan senyawa. Bidang ini juga mendukung karakterisasi modifikasi pasca-translasi dan terintegrasi dengan alur kerja proteomik dan spektrometri massa. Data dari eksperimen spektrometri massa diproses melalui saluran yang juga menggabungkan hasil dari ekstraksi dan pemurnian protein untuk memastikan kualitas sampel tercermin dalam analisis akhir.
