Proteomika adalah studi skala besar tentang protein, struktur, fungsi, interaksi, dan modifikasinya. Tidak seperti genom yang relatif statis, proteom bersifat dinamis dan mencerminkan keadaan sel, dengan ekspresi protein, lokalisasi, modifikasi, dan pergantian semuanya tunduk pada regulasi.

Prinsip Spektrometri Massa

Spektrometri massa mengukur rasio massa terhadap muatan molekul terionisasi. Spektrometer massa memiliki tiga komponen penting. Sumber ion mengubah molekul menjadi ion fase gas. Penganalisis massa memisahkan ion berdasarkan rasio massa terhadap muatannya. Detektor mengukur kelimpahan setiap ion. Protein dan peptida biasanya dianalisis menggunakan ionisasi elektrospray atau desorpsi ionisasi matriks berbantuan laser.

Ionisasi elektrospray menghasilkan ion bermuatan ganda dari peptida dalam larutan, menghasilkan serangkaian puncak dari mana massa molekul dapat dihitung. MALDI biasanya menghasilkan ion bermuatan tunggal dari peptida yang tergabung dalam matriks kristal dan didesorpsi oleh pulsa laser. Kedua metode adalah teknik ionisasi lunak yang mempertahankan integritas analit.

Penganalisis Massa

Beberapa jenis penganalisis massa digunakan dalam proteomika. Filter massa kuadrupol mentransmisikan ion dari rasio massa terhadap muatan yang dipilih melalui empat batang paralel dengan medan listrik berosilasi. Penganalisis waktu tempuh mengukur waktu yang dibutuhkan ion untuk menempuh jarak tetap, dengan ion yang lebih ringan tiba lebih cepat. Penganalisis Orbitrap menjebak ion dalam medan elektrostatik dan mengukur frekuensi osilasinya, memberikan resolusi tinggi dan akurasi massa. Penganalisis perangkap ion membatasi ion dalam medan listrik tiga dimensi dan mengeluarkannya secara berurutan. Instrumen hibrida yang menggabungkan beberapa jenis penganalisis, seperti kuadrupol-Orbitrap atau instrumen kuadrupol rangkap tiga, memberikan fleksibilitas untuk strategi eksperimental yang berbeda.

Proteomik Bottom-Up

Proteomik bottom-up menganalisis protein (sering dipisahkan dengan SDS-PAGE) setelah pencernaan menjadi peptida, biasanya menggunakan tripsin, yang membelah setelah residu arginin dan lisin. Campuran peptida yang dihasilkan dipisahkan oleh kromatografi cair dan dianalisis oleh spektrometri massa tandem. Dalam akuisisi dependen-data, spektrometer massa memilih ion peptida yang paling melimpah untuk fragmentasi oleh disosiasi akibat tumbukan. Spektrum ion fragmen yang dihasilkan dicocokkan dengan basis data sekuens protein untuk mengidentifikasi peptida dan protein induknya.

Spektrometri Massa Tandem

Dalam spektrometri massa tandem, ion prekursor dari rasio massa terhadap muatan tertentu dipilih dan difragmentasi, dan massa ion fragmen diukur. Disosiasi akibat tumbukan memfragmentasi peptida terutama pada ikatan amida, menghasilkan ion b dan y. Perbedaan massa antara ion y atau b yang berdekatan mengungkapkan sekuens asam amino. Metode fragmentasi energi tinggi seperti disosiasi transfer elektron memberikan informasi komplementer, mempertahankan modifikasi pasca-translasi yang labil.

Identifikasi Protein

Identifikasi protein dari spektrum massa tandem menggunakan mesin pencari basis data seperti Mascot, Sequest, atau MaxQuant. Massa ion fragmen yang diamati dibandingkan dengan spektrum teoretis yang dihasilkan dari digesti in silico sekuens protein dalam basis data. Analisis statistik menentukan kepercayaan setiap identifikasi. Pengurutan de novo, yang menurunkan sekuens peptida langsung dari spektrum massa tanpa basis data, digunakan untuk organisme dengan genom yang belum diurutkan atau untuk mengidentifikasi peptida baru.

Proteomik Kuantitatif

Proteomik kuantitatif mengukur perubahan kelimpahan protein antar kondisi. Metode berbasis label memperkenalkan tag isotop stabil yang dibedakan oleh pergeseran massa. SILAC menggabungkan asam amino berlabel isotop melalui pelabelan metabolik dalam kultur sel. TMT dan iTRAQ menggunakan tag kimia yang melepaskan ion reporter selama fragmentasi, memungkinkan kuantifikasi multipleks hingga 16 sampel. Kuantifikasi bebas label membandingkan intensitas ion peptida atau jumlah spektral antar lintasan, memerlukan normalisasi yang cermat.

Analisis Modifikasi Pasca-Translasi

Spektrometri massa sangat cocok untuk mengidentifikasi dan melokalisasi modifikasi pasca-translasi. Fosforilasi dideteksi oleh peningkatan massa karakteristik sebesar 80 Da dan kehilangan netral asam fosfat selama fragmentasi. Metode pengayaan seperti kromatografi afinitas ion logam terimobilisasi atau kromatografi titanium dioksida digunakan untuk memurnikan fosfopeptida sebelum analisis. Glikosilasi lebih menantang karena glikopeptida terfragmentasi dengan buruk dan struktur glikan heterogen. Metode fragmentasi khusus seperti disosiasi transfer elektron mempertahankan ikatan glikan-peptida, memungkinkan analisis spesifik-situs.

Proteomik Klinis

Proteomik klinis menerapkan teknologi proteomik pada masalah medis. Penemuan biomarker mengidentifikasi protein yang kelimpahannya berubah pada penyakit, memungkinkan diagnosis dini atau pemantauan pengobatan menggunakan teknik seperti ELISA. Proteomik jaringan menganalisis spesimen klinis yang difiksasi dengan formalin dan dibenamkan dalam parafin. Proteomik plasma menghadapi tantangan karena rentang dinamis konsentrasi protein yang sangat besar, dengan albumin saja merupakan lebih dari setengah total protein. Penipisan afinitas protein berlimpah dan fraksinasi ekstensif biasanya diperlukan untuk analisis proteom plasma yang dalam.