Western Blotting (juga disebut imunobloting protein) adalah teknik laboratorium yang digunakan untuk mendeteksi protein tertentu dalam sampel biologis yang kompleks. Sementara SDS-PAGE memisahkan protein berdasarkan ukuran, ia tidak dapat memberi tahu Anda protein mana yang mana — banyak protein berbeda dapat memiliki berat yang sama. Western Blotting memecahkan ini dengan menggunakan antibodi yang bertindak seperti rudal pencari panas, hanya mengikat satu protein spesifik yang ingin dipelajari oleh ilmuwan.
Cara Kerja Western Blotting
Setelah protein dipisahkan oleh SDS-PAGE, mereka masih terperangkap di dalam gel yang rapuh. Western blotting memindahkan mereka ke permukaan yang kokoh di mana mereka dideteksi menggunakan antibodi.
- Transfer
Protein dipindahkan dari gel poliakrilamida ke membran tipis dan tahan lama (biasanya nitroselulosa atau PVDF). Dengan menerapkan medan listrik tegak lurus terhadap gel, protein didorong keluar dari gel dan menempel kuat ke permukaan membran, menciptakan replika yang tepat dari pola pemisahan asli.
- Pemblokiran
Membran sangat lengket dan akan menangkap protein apa pun yang disentuhnya. Untuk mencegah antibodi menempel ke ruang kosong pada membran (yang akan menciptakan latar belakang gelap yang berantakan), membran direndam dalam larutan “pemblokiran” — seringkali campuran protein encer seperti susu kering tanpa lemak atau bovine serum albumin (BSA).
- Inkubasi Antibodi
Membran diperlakukan dengan Antibodi Primer yang dirancang untuk mengenali hanya protein target. Setelah mencuci antibodi primer yang tidak terikat, Antibodi Sekunder ditambahkan. Antibodi kedua ini mengenali yang pertama dan biasanya dilekatkan pada enzim atau pewarna fluoresen yang bertindak sebagai sinyal.
- Deteksi
Untuk melihat hasilnya, substrat kimia ditambahkan yang bereaksi dengan enzim pada antibodi sekunder, menghasilkan cahaya (kemiluminesensi) atau endapan berwarna. Ini menciptakan pita gelap pada selembar film atau gambar digital, mengonfirmasi tidak hanya ukuran protein, tetapi identitas pastinya dan berapa banyak yang ada.
