Sistem yeast two-hybrid mendeteksi interaksi protein-protein dalam sel ragi hidup dengan merekonstitusi faktor transkripsi fungsional. Ini adalah metode yang kuat dan banyak digunakan untuk menemukan dan mengkarakterisasi interaksi protein biner.

Prinsip

Sistem ini didasarkan pada sifat modular faktor transkripsi, yang memiliki domain pengikatan DNA dan aktivasi yang terpisah. Protein yang diminati, atau umpan, digabungkan ke domain pengikatan DNA dari faktor transkripsi seperti Gal4. Protein yang berpotensi berinteraksi, atau mangsa, digabungkan ke domain aktivasi. Interaksi antara umpan dan mangsa membawa domain aktivasi ke proksimitas dengan domain pengikatan DNA, merekonstitusi faktor transkripsi fungsional yang mengaktifkan ekspresi gen reporter.

Komponen

Umpan biasanya dikloning ke dalam vektor yang mengekspresikan protein umpan yang digabungkan ke domain pengikatan DNA Gal4. Mangsa diekspresikan dari vektor pustaka yang digabungkan ke domain aktivasi Gal4. Kedua plasmid ditransformasi ke dalam galur reporter ragi yang mengandung satu atau lebih gen reporter di bawah kendali sekuens aktivasi hulu yang responsif terhadap Gal4.

Gen reporter biasanya termasuk HIS3, yang memungkinkan pertumbuhan pada medium defisien histidin, ADE2 untuk biosintesis adenin, dan lacZ atau GFP untuk deteksi kolorimetri atau fluoresen. Beberapa reporter dengan promotor berbeda mengurangi positif palsu. Penanda yang dapat dipilih balik seperti URA3 dan CYH2 dapat menghilangkan positif palsu melalui seleksi negatif dalam kondisi tertentu.

Skrining Pustaka

Skrining Y2H tipikal dimulai dengan mengkonstruksi pustaka cDNA dalam vektor mangsa. Umpan ditransformasi ke dalam galur reporter ragi, dan pustaka mangsa diperkenalkan melalui transformasi skala besar. Transforman diplot pada medium selektif yang memerlukan interaksi untuk pertumbuhan. Koloni yang muncul setelah 3 hingga 7 hari dipetik, dan plasmid mangsa diperoleh kembali dan diurutkan untuk mengidentifikasi protein yang berinteraksi.

Skrining memerlukan optimasi yang cermat. Umpan harus diuji untuk autoaktivasi, di mana umpan saja mengaktifkan transkripsi reporter. Jika autoaktivasi terjadi, umpan dapat dipotong atau vektor alternatif dapat digunakan. Tingkat ekspresi umpan dan mangsa memengaruhi sensitivitas. Skrining throughput tinggi menggunakan otomatisasi dan strategi pengumpulan memungkinkan pemetaan interaksi seluruh proteom.

Kelebihan dan Keterbatasan

Y2H mendeteksi interaksi biner langsung dan dapat mengidentifikasi interaksi lemah atau sementara yang mungkin terlewatkan oleh ko-imunopresipitasi dan metode ekstraksi dan pemurnian protein biokimia lainnya. Sistem ini dapat diskalakan untuk throughput tinggi, hemat biaya, dan tidak memerlukan antibodi spesifik protein. Interaksi dideteksi dalam lingkungan sel eukariotik.

Keterbatasan termasuk positif palsu dari autoaktivator, protein lengket, dan interaksi kebetulan. Negatif palsu terjadi ketika protein gagal melipat dengan benar dalam ragi, memerlukan modifikasi pasca-translasi yang tidak ada dalam ragi, atau toksik ketika diekspresikan berlebih. Protein membran bermasalah karena lokalisasi nuklir dari sistem tidak kompatibel dengan lingkungan membran. Varian seperti sistem split-ubiquitin mengatasi beberapa keterbatasan ini.

Varian

Beberapa varian Y2H memperluas teknik dasar. Sistem reverse two-hybrid mendeteksi gangguan interaksi dengan skrining untuk hilangnya ekspresi reporter, berguna untuk mengidentifikasi mutasi atau obat yang mengganggu interaksi spesifik. Sistem one-hybrid mendeteksi interaksi protein-DNA dengan menggabungkan domain pengikatan DNA ke faktor transkripsi yang diketahui dan skrining untuk aktivasi. Sistem three-hybrid mendeteksi interaksi RNA-protein menggunakan molekul RNA hibrida yang menjembatani umpan dan mangsa.

Yeast two-hybrid membran menggunakan pendekatan split-ubiquitin, di mana umpan dan mangsa digabungkan ke bagian ubiquitin. Interaksi merekonstitusi ubiquitin penuh, yang dibelah oleh protease spesifik-ubiquitin, melepaskan faktor transkripsi yang mengaktifkan gen reporter. Ini memungkinkan deteksi interaksi yang melibatkan protein membran dalam lingkungan aslinya.

Aplikasi

Y2H telah digunakan untuk menghasilkan peta interaksi skala proteom untuk organisme termasuk ragi, lalat, cacing, dan manusia. Peta ini mengungkapkan modul fungsional, mengidentifikasi komponen jalur baru, dan memprediksi fungsi protein yang tidak dikarakterisasi. Skrining Y2H telah mengidentifikasi interaksi yang relevan dengan penyakit, seperti interaksi antara protein yang dikodekan oleh gen yang terkait dengan gangguan genetik. Teknologi ini juga telah diterapkan untuk memetakan interaksi inang-patogen, mengungkapkan bagaimana protein virus dan bakteri mengganggu mesin seluler inang.