A hibridização in situ (HIS) é uma técnica que usa sondas de ácido nucleico marcadas para detectar sequências específicas de DNA ou RNA diretamente em seções de tecido ou preparações citológicas. Diferentemente dos métodos moleculares baseados em extração (PCR, sequenciamento), a HIS preserva a arquitetura do tecido e mostra exatamente quais células contêm a sequência alvo.
Princípios
A HIS usa uma sonda — uma molécula de DNA ou RNA de fita simples complementar à sequência alvo. A sonda é marcada com um marcador detectável (isótopo radioativo, fluoróforo, hapteno). Após a desnaturação do DNA alvo (para HIS de DNA) ou sem desnaturação (para HIS de RNA), a sonda hibridiza à sequência alvo sob condições controladas de temperatura e salinidade. A sonda não ligada é lavada, e a sonda ligada é detectada por autorradiografia, microscopia de fluorescência ou detecção cromogênica baseada em enzima.
Stringência — a especificidade da hibridização é controlada pela temperatura e concentração de sal. Alta stringência (alta temperatura, baixo sal) permite apenas a formação de híbridos sonda-alvo perfeitamente pareados. Stringência mais baixa permite incompatibilidades parciais, que podem ser desejáveis para detectar sequências relacionadas, mas aumentam o fundo.
Hibridização In Situ por Fluorescência (FISH)
A FISH usa sondas marcadas com fluoróforo detectadas por microscopia de fluorescência. É o método de HIS mais amplamente usado em patologia diagnóstica. As sondas de FISH incluem: sondas de enumeração centromérica (CEP) — alvejam DNA alfa satélite específico de cromossomo nos centrômeros, usadas para detectar aneuploidia; sondas indicadoras específicas de locus (LSI) — alvejam sequências únicas em loci cromossômicos específicos, usadas para detectar amplificação gênica (HER2, EGFR) e deleção (1p/19q em oligodendroglioma); sondas break-apart — pares de sondas flanqueando um locus gênico; a separação indica translocação (ALK, ROS1, MYC, BCL2, BCL6, MALT1); sondas de fusão — uma sonda de cada lado de um ponto de quebra de translocação; sinais de fusão indicam a translocação.
FISH para HER2 — o padrão ouro para determinação do status de HER2 em câncer de mama e gástrico. Uma razão de sinais de HER2 (17q12) para sinais de CEP17 >2,0 é amplificada. A FISH é realizada quando a IHQ é equívoca (escore 2+).
FISH para ALK — FISH break-apart para rearranjo de ALK (2p23) em adenocarcinoma de pulmão detecta pacientes que respondem a inibidores de ALK (crizotinibe, alectinibe). A IHQ para ALK (clone D5F3) substituiu amplamente a FISH como teste de triagem primário, mas a FISH permanece como método confirmatório.
Hibridização In Situ Cromogênica (CISH)
A CISH usa sondas marcadas com hapteno detectadas por uma reação cromogênica baseada em enzima (DAB para marrom, Fast Red para vermelho). O sinal é visível ao microscópio de campo claro, permitindo avaliação simultânea da morfologia e do sinal de hibridização. A CISH é mais barata que a FISH (nenhum microscópio de fluorescência necessário), produz lâminas permanentes e é mais acessível em laboratórios de histopatologia de rotina.
Hibridização In Situ de RNA
A HIS de RNA detecta transcritos de mRNA específicos em seções de tecido. RNAscope (Advanced Cell Diagnostics) é uma tecnologia de HIS de RNA comercialmente disponível que usa uma estratégia de design de sonda (sondas Z duplas) que elimina o fundo de ligação inespecífica da sonda. Cada mRNA alvo aparece como um sinal em forma de ponto no citoplasma (ou núcleo para transcritos nascentes). O RNAscope é até 100 vezes mais sensível que a HIS de RNA tradicional e pode detectar tão poucas quanto 1-2 cópias de mRNA por célula.
As aplicações da HIS de RNA incluem: detecção de RNA viral (EBV EBER — o método padrão para identificar células infectadas por EBV no linfoma de Hodgkin, distúrbios linfoproliferativos pós-transplante, carcinoma nasofaríngeo); RNA de HPV (detecção de mRNA de E6/E7 confirma infecção por HPV transcricionalmente ativa); análise de expressão gênica (mRNA de PD-L1, expressão de citocinas em infiltrados inflamatórios); determinação de linhagem (detecção de transcritos específicos de tecido em tumores pouco diferenciados).
Aplicações Diagnósticas
Diagnóstico de linfoma — FISH para translocações de MYC, BCL2 e BCL6 em linfoma difuso de grandes células B (linfomas double-hit e triple-hit). HIS para EBER para EBV no linfoma de Hodgkin e distúrbio linfoproliferativo pós-transplante.
Diagnóstico de sarcoma — FISH para SS18 (sarcoma sinovial), FKHR (rabdomiossarcoma alveolar), EWSR1 (sarcoma de Ewing, tumor desmoplásico de células pequenas redondas) e MDM2 (lipossarcoma bem diferenciado/desdiferenciado).
Câncer de pulmão — FISH para ALK, FISH para ROS1 e FISH para amplificação de MET para seleção de terapia alvo.
Câncer de mama — FISH para HER2 em casos de IHQ equívoca.
Limitações
A FISH requer microscopia de fluorescência e software especializado para enumeração de sinais. A penetração da sonda em seções de tecido espesso pode ser incompleta. Desbotamento do sinal — os fluoróforos fotobranqueiam com excitação prolongada; as lâminas devem ser armazenadas no escuro. Desafios de interpretação incluem núcleos cortados (artefatos de truncamento em seções de parafina podem deletar sinais — usar seções de 4 µm), sinais sobrepostos e polissomia. Degradação de RNA em tecido mal preservado causa HIS de RNA falso-negativa. A garantia de qualidade inclui validação regular com controles positivos e negativos conhecidos, participação em programas de EQA e critérios de interpretação documentados.
