L’hybridation in situ (HIS) est une technique qui utilise des sondes d’acides nucléiques marquées pour détecter des séquences spécifiques d’ADN ou d’ARN directement dans des coupes tissulaires ou des préparations cytologiques. Contrairement aux méthodes moléculaires basées sur l’extraction (PCR, séquençage), l’HIS préserve l’architecture tissulaire et montre exactement quelles cellules contiennent la séquence cible.

Principes

L’HIS utilise une sonde — une molécule d’ADN ou d’ARN simple brin complémentaire de la séquence cible. La sonde est marquée avec un marqueur détectable (isotope radioactif, fluorophore, haptène). Après dénaturation de l’ADN cible (pour l’HIS ADN) ou sans dénaturation (pour l’HIS ARN), la sonde s’hybride à la séquence cible dans des conditions contrôlées de température et de salinité. La sonde non liée est éliminée par lavage, et la sonde liée est détectée par autoradiographie, microscopie à fluorescence ou détection chromogénique enzymatique.

Stringence — la spécificité de l’hybridation est contrôlée par la température et la concentration saline. Une stringence élevée (température élevée, faible salinité) permet uniquement la formation d’hybrides sonde-cible parfaitement appariés. Une stringence plus faible permet des discordances partielles, ce qui peut être souhaitable pour détecter des séquences apparentées mais augmente le bruit de fond.

Hybridation In Situ en Fluorescence (FISH)

Le FISH utilise des sondes marquées par fluorophore détectées par microscopie à fluorescence. C’est la méthode HIS la plus utilisée en pathologie diagnostique. Les sondes FISH incluent : sondes de numération centromérique (CEP) — ciblent l’ADN satellite alpha spécifique des chromosomes dans les centromères, utilisées pour détecter l’aneuploïdie ; sondes indicatrices spécifiques de locus (LSI) — ciblent des séquences uniques à des loci chromosomiques spécifiques, utilisées pour détecter l’amplification génique (HER2, EGFR) et la délétion (1p/19q dans l’oligodendrogliome) ; sondes break-apart — paires de sondes flanquant un locus génique ; la séparation indique une translocation (ALK, ROS1, MYC, BCL2, BCL6, MALT1) ; sondes de fusion — une sonde de chaque côté d’un point de cassure de translocation ; les signaux de fusion indiquent la translocation.

HER2 FISH — l’étalon-or pour la détermination du statut HER2 dans le cancer du sein et gastrique. Un rapport des signaux HER2 (17q12) sur les signaux CEP17 >2,0 est amplifié. Le FISH est réalisé lorsque l’IHC est équivoque (score 2+).

ALK FISH — FISH break-apart pour le réarrangement ALK (2p23) dans l’adénocarcinome pulmonaire détecte les patients qui répondent aux inhibiteurs ALK (crizotinib, alectinib). L’IHC ALK (clone D5F3) a largement remplacé le FISH comme test de dépistage primaire, mais le FISH reste la méthode de confirmation.

Hybridation In Situ Chromogénique (CISH)

Le CISH utilise des sondes marquées par haptène détectées par une réaction chromogénique enzymatique (DAB pour le brun, Fast Red pour le rouge). Le signal est visible au microscope à champ clair, permettant l’évaluation simultanée de la morphologie et du signal d’hybridation. Le CISH est moins cher que le FISH (pas de microscope à fluorescence nécessaire), produit des lames permanentes et est plus accessible dans les laboratoires d’histopathologie de routine.

Hybridation In Situ d’ARN

L’HIS ARN détecte des transcrits d’ARNm spécifiques dans les coupes tissulaires. RNAscope (Advanced Cell Diagnostics) est une technologie d’HIS ARN commerciale utilisant une stratégie de conception de sonde (sondes double Z) qui élimine le bruit de fond dû à la liaison non spécifique des sondes. Chaque ARNm cible apparaît comme un signal ponctiforme dans le cytoplasme (ou le noyau pour les transcrits naissants). RNAscope est jusqu’à 100 fois plus sensible que l’HIS ARN traditionnelle et peut détecter aussi peu que 1-2 copies d’ARNm par cellule.

Les applications de l’HIS ARN incluent : détection d’ARN viral (EBV EBER — la méthode standard pour identifier les cellules infectées par l’EBV dans le lymphome de Hodgkin, les troubles lymphoprolifératifs post-transplantation, le carcinome nasopharyngé) ; ARN HPV (la détection de l’ARNm E6/E7 confirme une infection HPV transcriptionnellement active) ; analyse d’expression génique (ARNm PD-L1, expression de cytokines dans les infiltrats inflammatoires) ; détermination de lignée (détection de transcrits tissu-spécifiques dans les tumeurs peu différenciées).

Applications Diagnostiques

Diagnostic des lymphomes — FISH pour les translocations MYC, BCL2 et BCL6 dans les lymphomes diffus à grandes cellules B (lymphomes double-hit et triple-hit). HIS EBER pour l’EBV dans le lymphome de Hodgkin et le trouble lymphoprolifératif post-transplantation.

Diagnostic des sarcomes — FISH pour SS18 (sarcome synovial), FKHR (rhabdomyosarcome alvéolaire), EWSR1 (sarcome d’Ewing, tumeur desmoplasique à petites cellules rondes) et MDM2 (liposarcome bien différencié/dédifférencié).

Cancer du poumon — FISH ALK, FISH ROS1 et FISH amplification MET pour la sélection de thérapie ciblée.

Cancer du sein — FISH HER2 pour les cas IHC équivoques.

Limites

Le FISH nécessite une microscopie à fluorescence et un logiciel spécialisé pour le comptage des signaux. La pénétration des sondes dans les couches tissulaires épaisses peut être incomplète. L’atténuation du signal — les fluorophores photoblanchissent avec une excitation prolongée ; les lames doivent être stockées à l’obscurité. Les défis d’interprétation incluent les noyaux coupés (artefacts de troncature dans les coupes en paraffine pouvant supprimer les signaux — utiliser des coupes de 4 µm), les signaux qui se chevauchent et la polysomie. La dégradation de l’ARN dans les tissus mal conservés provoque une fausse négativité de l’HIS ARN. L’assurance qualité inclut une validation régulière avec des contrôles positifs et négatifs connus, la participation à des programmes d’EEQ et des critères d’interprétation documentés.