原位杂交（ISH）是一种使用标记核酸探针直接在组织切片或细胞学制备中检测特定DNA或RNA序列的技术。与基于提取的分子方法（PCR、测序）不同，ISH保留了组织结构，并准确显示哪些细胞含有靶序列。

原理

ISH使用探针——一种与靶序列互补的单链DNA或RNA分子。探针用可检测的标记物（放射性同位素、荧光团、半抗原）标记。在靶DNA变性后（对于DNA ISH）或无需变性（对于RNA ISH），探针在受控的温度和盐浓度条件下与靶序列杂交。未结合的探针被洗去，结合的探针通过放射自显影、荧光显微镜或基于酶的显色检测进行检测。

严谨性——杂交的特异性通过温度和盐浓度来控制。高严谨性（高温、低盐）仅允许完全匹配的探针-靶标杂交体形成。较低的严谨性允许部分错配，这对于检测相关序列可能是理想的，但会增加背景。

荧光原位杂交（FISH）

FISH使用荧光团标记的探针，通过荧光显微镜检测。它是诊断病理学中使用最广泛的ISH方法。FISH探针包括：着丝粒计数探针（CEP）——靶向着丝粒中染色体特异性的α卫星DNA，用于检测非整倍体；位点特异性指示探针（LSI）——靶向特定染色体位点的独特序列，用于检测基因扩增（HER2、EGFR）和缺失（少突胶质细胞瘤中的1p/19q）；断裂分离探针——位于基因位点两侧的探针对；分离提示易位（ALK、ROS1、MYC、BCL2、BCL6、MALT1）；融合探针——易位断点两侧各一个探针；融合信号提示易位。

HER2 FISH——确定乳腺癌和胃癌HER2状态的金标准。HER2（17q12）信号与CEP17信号之比>2.0为扩增。当IHC不确定（2+评分）时进行FISH。

ALK FISH——肺腺癌中ALK（2p23）重排的断裂分离FISH可识别对ALK抑制剂（克唑替尼、阿来替尼）有反应的患者。ALK IHC（D5F3克隆）已基本取代FISH作为主要筛查检测，但FISH仍然是确认方法。

显色原位杂交（CISH）

CISH使用半抗原标记的探针，通过基于酶的显色反应（DAB为棕色，Fast Red为红色）进行检测。信号在明视野显微镜下可见，允许同时评估形态学和杂交信号。CISH比FISH便宜（无需荧光显微镜），产生永久性玻片，并且在常规组织病理学实验室中更易获得。

RNA原位杂交

RNA ISH检测组织切片中特定的mRNA转录本。RNAscope（Advanced Cell Diagnostics）是一种市售的RNA ISH技术，使用探针设计策略（双Z探针），消除了非特异性探针结合的背景。每个靶mRNA在胞质（或未成熟转录本的细胞核中）表现为点状信号。RNAscope比传统RNA ISH灵敏高达100倍，可检测每个细胞少至1-2个mRNA拷贝。

RNA ISH的应用包括：检测病毒RNA（EBV EBER——识别霍奇金淋巴瘤、移植后淋巴组织增殖性疾病、鼻咽癌中EBV感染细胞的标准方法）；HPV RNA（E6/E7 mRNA检测确认转录活跃的HPV感染）；基因表达分析（PD-L1 mRNA、炎性浸润物中的细胞因子表达）；谱系确定（在低分化肿瘤中检测组织特异性转录本）。

诊断应用

淋巴瘤诊断——弥漫性大B细胞淋巴瘤中MYC、BCL2和BCL6易位的FISH（双打击和三打击淋巴瘤）。霍奇金淋巴瘤和移植后淋巴组织增殖性疾病中的EBER ISH。

肉瘤诊断——SS18（滑膜肉瘤）、FKHR（腺泡状横纹肌肉瘤）、EWSR1（尤文肉瘤、促纤维组织增生性小圆细胞瘤）和MDM2（高分化/去分化脂肪肉瘤）的FISH。

肺癌——用于靶向治疗选择的ALK FISH、ROS1 FISH和MET扩增FISH。

乳腺癌——不确定IHC病例中的HER2 FISH。

局限性

FISH需要荧光显微镜和用于信号计数的专用软件。探针穿透在厚组织切片中可能不完全。信号褪色——荧光团在长时间激发下会发生光漂白；玻片应在暗处储存。解读挑战包括切割的细胞核（石蜡切片中的截断伪影可能删除信号——使用4 µm切片）、重叠信号和多体性。RNA降解在保存不良的组织中导致假阴性RNA ISH。质量保证包括使用已知阳性和阴性对照进行定期验证、参与EQA项目以及记录在案的解读标准。